Обнаружение белка.

Проба с бромфеноловым синим.

В норме белок в моче не обнаруживают.

Принцип метода.

Изменение окраски индикатора в присутствии белка.

Необходимые реактивы.

1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

2. Натрия ацетат (NaOOCCH₃ × 3Н₂О).

3. НСl 0,1 моль/л.

4. Барбитал-ацетатный буфер рН 8,6: 8,6 г мединала и 6,48 г ацетата натрия растворяют в 100 мл воды, добавляют 60 мл НСl и доводят до 1 л водой.

5. Бромфеноловый синий водорастворимый.

6. Цинка сульфат (ZnSO₄ × 7Н₂О).

7. Раствор индикатора: 0,5 г бромфенолового синего и 50 г сульфата цинка растворяют в 1 л воды.

8. Уксусная кислота: к 1 мл концентрированной уксусной кислоты добавляют 99 мл воды.

9. Раствор альбумина: 10 г альбумина растворяют в 1 л изотонического раствора хлорида натрия (9 г/л), рабочие растворы альбумина готовят путем разведения основного раствора в 2; 4; 8 и 16 раз водой.

10. Натр едкий 0,02 моль/л.

Ход исследования.

На фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную барбитал-ацетатным буфером и высушенную, наносят 0,02 мл исследуемой мочи.

После высыхания бумагу с нанесенной пробой окрашивают индикатором, а избыток краски отмывают раствором уксусной кислоты в течение 5–7 мин.

Результат оценивают визуально, сравнивая окраску в опыте с окраской, которую дают стандартные растворы альбумина, обработанные так же, как и опытная проба. Метод позволяет обнаружить в моче белок, содержание которого составляет 2 мкг в пробе.

Проба на гипераминоацидурию.

Выделение аминоазота за сутки не превышает 1–2 мг/кг. В ночное время выделяется 2/3–3/4 суточного количества аминоазота.

Гипераминоацидурия возникает при наследственной (синдром Дебре – де Тони – Фанкони) и приобретенной (гломерулонефрит) патологии в почках, а также при некоторых заболеваниях печени. Для выяснения причины гипераминоацидурии необходимы определение концентрации аминокислот в крови и моче и вычисление их клиренса.

Принцип метода.

Аминокислоты при нагревании с нингидрином образуют соединения, окрашенные в сине-фиолетовый цвет.

Необходимые реактивы.

1. Нингидрин.

2. Ацетон.

3. Уксусная кислота (ледяная).

4. Раствор нингидрина: 5 г нингидрина на 1 л смеси (к 0,5 г нингидрина прибавляют 95 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной воды).

5. Гликолол (глицин).

6. Раствор глицина: 150 мг глицина растворяют в 100 мл дистиллированной воды (1 мл раствора содержит 1,5 мг глицина, что соответствует 0,28 мг аминоазота). Из данного раствора глицина готовят серию разведений: 1; 3, 6; 9; 18; 24; 36; 54 мл раствора глицина доводят до 100 мл водой. Приготовленные растворы соответствуют 0,28; 0,84; 1,68; 2,52; 5,04; 6,72; 10,08; 16,12 мг аминоазота в 100 мл.

Растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.

Ход исследования.

На фильтровальную бумагу наносят 0,02 мл мочи и после подсушивания окрашивают раствором нингидрина, затем высушивают на воздухе до полного исчезновения запаха уксусной кислоты и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С на 15 мин.

Окраску опыта сравнивают с окраской стандартных растворов глицина, обработанных так же, как образец мочи, для чего берут по 0,02 мл каждого раствора. Результаты выражают в миллиграммах аминоазота, выделенного с мочой за сутки.

Обнаружение цистина и гомоцистина.

Принцип метода.

Азид натрия и йод образуют комплекс бурого цвета, который обесцвечивается в присутствии цистина и гомоцистина.

Необходимые реактивы.

1. Натрия азид.

2. Йод кристаллический.

3. Раствор йода: 12,69 г кристаллического йода отвешивают в бюксе, растворяют в насыщенном растворе йодида калия (37 г KI в 26 мл дистиллированной воды), переносят в колбу и доливают дистиллированной водой до 1 л. Можно использовать фиксанал йода 0,1 н.

4. Этиловый спирт 96%-ный.

5. Раствор азида натрия: 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл раствора йода и доводят объем этиловым спиртом до 100 мл. Раствор хранят в посуде темного стекла в холодильнике.

Ход исследования.

Каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют 1 каплю раствора азида натрия. В течение 5 мин наблюдают за исчезновением бурой окраски.

По времени исчезновения окраски судят о наличии аминокислот в исследуемой моче. Для полуколичественной оценки результатов окраску пробы можно сравнивать с цветной шкалой, для получения которой готовят раствор цистина и гомоцистина, содержащий 0,6 мг каждой аминокислоты в 1 мл.

Из этого раствора готовят растворы с содержанием аминокислот от 0,6 до 0,3 мг/мл. Нижняя граница чувствительности пробы – 0,3 мг/мл.

Бурая окраска в норме исчезает через 2–3 мин после добавления азида натрия.

Ложноположительную реакцию дают ангидрид аргинин-янтарной кислоты, ацетон, некоторые лекарственные препараты.

Тест положительный при наследственной или приобретенной цистинурии или гомоцистинурии, в этом случае окраска остается более 5 мин.

Обнаружение пролина и других аминокислот.

Пролинурия возможна при патологии почек и как симптом наследственного нарушения обмена.

Принцип метода.

Изатин образует с некоторыми аминокислотами специфически окрашенные соединения.

Необходимые реактивы.

1. Изатин.

2. Ацетон.

3. Раствор изатина в ацетоне 0,2 г/л (раствор хранят в холодильнике при температуре 4 °С.

4. Соляная кислота 1 моль/л.

Ход исследования.

Фильтровальную бумагу пропитывают раствором изатина в ацетоне и высушивают. Затем наносят на нее одну каплю мочи и высушивают при 100 °С в течение 10 мин, смачивают раствором соляной кислоты и промывают водой.

Сине-серую окраску дает повышенное содержание фенилаланина, коричневую – триптофан, пурпурную – смесь различных аминокислот, а появление синей окраски в виде ободка свидетельствует о присутствии в моче свободного пролина (не менее 0,1 мг/мл). Можно сравнивать интенсивность окраски с цветной шкалой. Для приготовления стандартных растворов, содержащих от 0,1 до 0,5 мг/мл соответствующих аминокислот, используют растворы аминокислот с исходной концентрацией 0,5 мг соответствующей аминокислоты в 1 мл раствора.

Обнаружение кетокислот (проба с треххлористым железом).

Кетокислоты в большом количестве выделяются с мочой при нарушении различных обменных процессов, в частности цикла Кребса; производные фенотиазида или салицилата – при отравлениях ими; 3-оксиантраниловая кислота – при нарушениях обмена триптофана.

Принцип метода.

Треххлористое железо в присутствии НСl дает с кетокислотами специфически окрашенные соединения.

Необходимые реактивы.

1. Железо треххлористое (FeCl₃ × 6Н₂О), 10%-ный раствор.

2. НСl, 10%-ный раствор.

3. Аммиак водный концентрированный.

4. Магния хлорид (MgCl₂ × 6Н₂О): к 11 г хлорида магния прибавляют 20 мл концентрированного водного аммиака и объем доводят водой до 1 л.

Ход исследования.

Вариант I – к 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа, при положительной реакции появляется темно-зеленый осадок.

Вариант II – для связывания фосфатов, мешающих реакции, к 4 мл мочи прибавляют 1 мл раствора хлорида магния, перемешивают и через 5 мин фильтруют. К фильтрату добавляют по 2 капли раствора соляной кислоты и раствора треххлористого железа; в течение 5 мин наблюдают развитие окраски.

О наличии кетокислот судят по характеру окраски, однако следует иметь в виду, что окраска может развиваться и за счет других соединений (табл. 37).

Таблица 37.

Цветная реакция различных соединений с треххлористым железом.

Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Принцип метода.

Кетокислоты образуют с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенные гидразоны.

Необходимые реактивы.

1. НСl, 2 моль/л.

2. 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ): 2 г 2,4-ДНФГ растворяют в 1 л 2 моль/л НСl.

3. Диэтиловый эфир.

4. Натрия карбонат (NаО₂СО₃), 100 г/л.

Ход исследования.

Смешивают 1 мл раствора 2,4-ДНФГ и 0,25 мл мочи. Через 10 мин прибавляют 1,25 мл диэтилового эфира и перемешивают, эфирный слой отсасывают и переносят в пробирку, куда добавляют равный объем раствора натрия карбоната. Содержимое пробирки перемешивают.

При положительной пробе развивается окраска от желтой до оранжево-коричневой. В норме проба отрицательная, окраска не развивается.

Обнаружение гомогентизиновой кислоты.

Принцип метода.

В щелочной среде гомогентизиновая кислота окисляется с образованием соединений сине-фиолетового цвета.

Необходимый реактив.

Едкий натр, 100 г/л.

Ход исследования.

К 0,5 мл мочи прибавляют 3–4 капли раствора едкого натра, результат оценивают через 1–2 мин.

При положительной реакции развивается сине-фиолетовое окрашивание, при отрицательной окраска не возникает.

Обнаружение индикана.

Принцип метода.

Превращение индикана в индоксил после гидролиза эфирной связи сильной минеральной кислотой и последующее окисление индоксила треххлористым железом с образованием окрашенного соединения.

Необходимые реактивы.

1. Свинца ацетат (СН₃СОО)Рb × 3Н₂О), 100 г/л раствора.

2. НСl концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl₃ × 6Н₂О).

4. Реактив Обермейра: 0,4 г треххлористого железа растворяют в 100 мл концентрированной НСl.

5. Хлороформ.

6. Натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃ × 5H₂O), 200 г/л раствора.

Ход исследования.

К 4 мл мочи прибавляют 0,4 мл раствора ацетата свинца для осаждения желчных пигментов, солей и других веществ, мешающих реакции.

Фильтруют, 1–2 мл фильтрата смешивают с равным объемом реактива Обермейра, прибавляют 0,5–1 мл хлороформа и осторожно перемешивают.

Если слой хлороформа окрашивается в синий или красный цвет, его отсасывают и добавляют к нему 2–3 капли тиосульфата натрия.

При положительной реакции окраска хлороформа не исчезает после добавления тиосульфата натрия. В норме реакция отрицательная.

Обнаружение фруктозы (проба Селиванова).

Принцип метода.

При нагревании фруктозы с резорцином в кислой среде образуются соединения, окрашенные в красный цвет.

Необходимые реактивы.

1. НСl, 1 моль/л.

2. Резорцин: 5 г в 1 л, 1 моль/л раствора НСl.

Ход исследования.

К 2 мл мочи приливают 1 мл раствора резорцина и нагревают до закипания.

При положительной пробе развивается интенсивное красное окрашивание. В норме окраска не появляется.

Оценку пробы проводят в момент закипания, так как при длительном кипении окраска может развиться при наличии глюкозы. Пищевая нагрузка медом и фруктами может дать положительную пробу.

Обнаружение лактозы и мальтозы (проба Велька).

Принцип метода.

Лактоза и мальтоза в щелочной среде при нагревании с аммиаком образуют окрашенные соединения.

Необходимые реактивы.

1. Аммиак водный концентрированный.

2. Калий едкий, 200 г/л раствора.

Ход исследования.

К 5 мл мочи приливают 2,5 мл аммиака и 0,2 мл раствора едкого калия. Нагревают на водяной бане в течение 30 мин при температуре 60 °С.

При положительной реакции на лактозу появляется коричневая окраска, а при наличии мальтозы – красная окраска. В норме окраска не развивается.

Обнаружение пентоз (проба Биаля).

Принцип метода.

Пентозы с орцином и треххлористым железом при нагревании в кислой среде образуют окрашенные соединения.

Необходимые реактивы.

1. 5-метилрезорцин (орцин).

2. НСl концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl₃ × 6Н₂О), 100 г/л раствора.

4. Реактив Биаля: 1 г орцина растворяют в 500 мл соляной кислоты и добавляют 1 мл раствора треххлористого железа.

Ход исследования.

Нагревают 1 мл мочи до кипения с 5 мл реактива Биаля.

При положительной пробе появляется яркая желто-зеленая окраска. В норме проба отрицательная.

Обнаружение глюкозы, фруктозы, пентозы, лактозы и мальтозы в моче может быть результатом врожденных ферментопатий, а лактоза и мальтоза могут быть обнаружены при нарушении их гидролиза в тонкой кишке.

Обнаружение гликозоаминогликанов (проба с метилтриметил-аммония бромидом).

Принцип метода.

Метилтриметиламмония бромид (ЦТАБ) с гликозамино-гликанами образует в кислой среде белый осадок.

Необходимые реактивы.

1. Лимонная кислота.

2. Едкий натр.

3. Цитратный буфер, 1 ммоль/л, рН 5,7: в небольшом количестве воды растворяют 210 г лимонной кислоты, добавляют 120 г едкого натра, растворяют, охлаждают и доливают водой до 1 л.

4. Раствор ЦТАБ, 25 г в 1 л цитратного буфера.

Ход исследования.

К 5 мл мочи приливают 1 мл раствора ЦТАБ и в течение 30 мин наблюдают образование осадка. Пробу проводят при комнатной температуре, для исследования берут свежевыделенную мочу.

Проба считается положительной при образовании осадка. В норме проба отрицательная. Следует учитывать, что проба дает 40% ложноположительных результатов.

Определение кальция (проба Сулковича).

Высокое содержание кальция в моче может быть при гипервитаминозе D и гиперпаратиреозе.

Принцип метода.

Ионы кальция со щавелевой кислотой образуют нерастворимую щавелевокислую соль.

Необходимые реактивы.

1. Щавелевая кислота.

2. Аммония оксалат.

3. Уксусная кислота ледяная.

4. Реактив Сулковича: в 50 мл дистиллированной воды растворяют по 2,5 г щавелевой кислоты и оксалата аммония, добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора до 150 мл.

Ход исследования.

Смешивают по 0,5 мл мочи и реактива Сулковича. Через 1–2 мин оценивают степень помутнения.

Степень помутнения оценивают визуально:

– 0 – отсутствие помутнения;

– 1 – слабое помутнение;

– 2 – умеренное помутнение;

– 3 – значительное помутнение;

– 4 – резко выраженное помутнение.

О повышенном содержании кальция в моче свидетельствуют 3 и 4-я степени помутнения.

После выявления положительных результатов описанных тестов больной нуждается в тщательном обследовании с помощью точных количественных методов в специализированных учреждениях.