11. Использование вирусов в генной терапии.

Вирусы против вирусов.

Принцип генной терапии очень прост: природа предоставляет нам вирусы, способные быть носителями онкогенов, а вирусологи заменяют онкогены терапевтическими генами. Таким образом, онкогенные вирусы являются болезнетворными, а терапевтические оказывают лечебное действие. Генная терапия использует принцип, которого придерживаются все вирусы, – перенос генов. В этом заключается основная роль вирусов в процессе эволюции.

Вирусы столь успешны в индуцировании болезней, потому что они размножаются в организме до астрономических чисел, – и вот тут-то возникает проблема, поскольку размножение терапевтических вирусов недопустимо. В этом смысле терапевтические вирусы преуспели гораздо меньше. Такое ограничение задается самим человеком, поскольку реплицирующиеся вирусы могут оказаться опасными. Они могут проникнуть в половые клетки и передаться будущим поколениям. Мы не берем на себя смелость манипулировать генами наших потомков, никому не хочется, чтобы это произошло. Довольно сложно разработать вирусы, которые не реплицировались бы при любых условиях, поскольку вирусы «учатся» очень быстро и часть их может «сбежать». Производимые вирусы должны быть безопасными. В большинстве случаев для целей генной терапии применяют ретровирусы. Однако можно модифицировать и большое количество других вирусов и синтетических вирусов. Вирусы, используемые для генной терапии, являются сложными «дизайнерскими вирусами».

При инфицировании нормальной клетки опухолевый вирус превращает такую клетку в опухолевую, но возможен и обратный процесс – опухолевую клетку можно обработать вирусом – носителем терапевтических генов с целью «излечения» такой клетки, в результате чего она становится нормальной. Терапевтический ген должен быть способен компенсировать мутации, обусловившие злокачественный фенотип опухолевой клетки. Генная терапия может быть показана и для лечения других генетических или метаболических заболеваний. Сложно найти правильный ген и наиболее подходящий вирус. Что касается применения любого вируса, всегда есть определенные за и против. Ретровирусы до сих пор являются наиболее тщательно изученными из всех вирусов, которые можно использовать в качестве терапевтических. Они незаменимы для переноса генов в клетки, особенно в лабораторных условиях. В мире не существует ни одной биомолекулярной лаборатории, где ретровирусные векторы не использовались бы в качестве повседневного инструмента для переноса генов. На самом же деле это не совсем так, поскольку для этого нужна лаборатория второго уровня биобезопасности. Мы располагали помещением, отвечающим таким требованиям, поэтому могли синтезировать широкий спектр различных вирусов для своих коллег. Ретровирусы интегрируются в геном хозяина, что рассматривалось как одно из важных преимуществ, поскольку от вирусов ожидали долговременной эффективности. И все же их эффективность не всегда является долгосрочной, и такие вирусы могут представлять опасность, поскольку интеграция в геном часто представляет собой генотоксическое явление, вызывая локальное повреждение ДНК, которое может индуцировать развитие рака как отдаленное последствие терапии. Поэтому лечение рака может вызвать развитие других видов рака. Но даже при этом подобная терапия позволяет пациенту выиграть время и улучшить состояние здоровья.

Совершенно неожиданно результаты доклинических исследований ретровирусов показали, что экспрессия терапевтических генов не всегда носит долгосрочный характер и со временем угасает, несмотря на интеграцию. Это вызвано реакцией организма на инородный ген и ведет к его отключению. Явление, при котором «инородные» гены инактивируются противовирусной защитой, называется сайленсингом. Защита обусловливает эпигенетические изменения, направленные на инактивацию генов, что было описано при исследовании генов цвета у кукурузы и мышей (этот процесс предусматривает метилирование ДНК-последовательностей и другие процессы, направленные на инактивацию генов). Данный механизм сайленсинга, очевидно, носит более выраженный характер у взрослых, поскольку применение генной терапии с использованием ретровируса для лечения детей с гранулематозом (заболевание кровеносных сосудов) привело к их исцелению, в то время как один взрослый пациент через два года умер. В такие исследования включается очень незначительное число пациентов, и объем статистических данных не удовлетворяет соответствующим требованиям. Однако вполне возможно, что терапевтический эффект у детей более долгосрочный, чем у взрослых.

Существуют альтернативные варианты: вместо того чтобы замещать гены, пораженные заболеванием, генную терапию можно проводить путем стимуляции иммунной системы пациента, чтобы помочь ему бороться с опухолью, то есть «помочь людям помочь себе». Иммунная терапия может предусматривать использование генов, кодирующих цитокины, что приводит не к местному, а к системному эффекту. Мы использовали такой фактор, интерлейкин 12 (еще его называют фактором, стимулирующим Т-клетки), который активирует клетки-киллеры, повышая уровень некоторых типов интерферона, – это целая комбинация компонентов, направленных на борьбу с раком.

Самое важное ограничение в плане использования вирусов заключается в том, что они не должны реплицироваться. Вирус не должен переходить из одной клетки в другую.

Каждая клетка – тупик для терапевтического вируса, он может в нее войти, но не может выйти. Вирусы следует вводить в соматические клетки – особенно раковые и в клетки, пораженные заболеванием, – чтобы уничтожить или излечить их, но нельзя допустить, чтобы эти вирусы оказались в кровотоке, откуда они случайно могут попасть в половые клетки и передаться следующим поколениям. Шанс попадания вируса в половые клетки повышается, если вирус активно реплицируется. Такое развитие событий строго запрещено, и изначально это пошло от ученых-исследователей, придерживающихся принципа самоограничения. В настоящее время соответствующими регуляторными органами введены строгие правила . При отсутствии репликации для каждой опухолевой клетки требуется по одному терапевтическому вирусу. Это сложно. Размер опухоли определяется в кубических сантиметрах (это 1 мл или примерно 1 г), в каждом содержится около 109 клеток. Следовательно, если каждый вирус обнаруживает одну клетку, для лечения такой опухоли потребовалось бы как минимум 109 вирусов. Однако возможна выработка не более чем 1/100 или 1/1000 от этого числа (20 млн вирусов в 1 мл). Поэтому потребуется слишком большой объем введения, и, кроме того, вирусы достигают не всех опухолевых клеток. Это объясняет ограничения генной терапии с использованием вирусных векторов, так как для обеспечения эффективности необходима репликация вирусов. Именно для этого их и создала природа. Более того, невозможно добраться до каждой из клеток, поэтому всегда имеет место «минимальное остаточное заболевание». Если сохраняется даже немного раковых клеток, этого зачастую бывает достаточно для увеличения их числа и возвращения опухоли.

Чтобы не допустить производства способных к репликации вирусов, их часто разрезают на части, их гены фрагментируют на 3–4 субвирусные генетические части вместо одной, а затем «упаковывают» в вирусную частицу. Эти части состоят из плазмидной ДНК, и каждая из них может кодировать ограниченный комплект генов. Лентивирусы были созданы для замены более простых ретровирусов. Они являются родственниками ВИЧ. На первый взгляд это кажется устрашающим, но только для читателя и для регуляторных органов. У лентивирусов есть определенные преимущества, поскольку они проявляют активность в неделящихся клетках (в частности, в нейронных клетках). Их можно сделать безопасными. Существуют способы обеспечить такую безопасность путем удаления некоторых генов вирусов или фрагментации и поиска разумных способов предотвратить их превращение в полноценный инфицирующий вирус. На какое-то время эти фрагменты можно соединять и использовать для инфицирования опухолей, и при этом каждая частица поражает одну клетку. Эту систему разработал лауреат Нобелевской премии Дэвид Балтимор из Калифорнийского технологического института (Пасадена).

Студент из Берлина, проходивший летнюю практику в Цюрихе, очень удивил меня вирусом Балтимора. Он просто написал Дэвиду в США и попросил у него терапевтический вирус, а затем без каких-либо проблем привез его в рюкзаке. Я была потрясена! Мы, как полагается, поместили вирус в помещение с надлежащей системой безопасности. Вероятнее всего, наличие на коробке печатного фирменного бланка с моим именем и послужило бесплатным билетом!

Еще одна сложность генной терапии заключается в способе обнаружения вирусом опухолевой клетки в организме. Можно попытаться использовать гиподермическую иглу и ввести суспензию прямо в опухоль или в пространство вокруг нее. Такой способ оказывается эффективным лишь в отношении некоторых опухолей. Мы вводили терапевтические плазмидные ДНК в злокачественные меланомы, которые формируют локальные кожные опухоли. Побочные действия такой терапии для пациентов оказываются менее выраженными, а локальная доза выше системной дозы, которая, попав в кровь, перемещалась бы по всему организму. Однако данная терапия бесполезна против генерализированных метастазов, которые мигрируют в удаленное местоположение. Можно попытаться направить вирус на какую-нибудь дистантную опухоль или метастатическую клетку, используя поверхностные маркеры, своего рода молекулярный адрес. Это принцип идентичен принципу, созданному природой для направления вируса на соответствующую клетку-мишень. ВИЧ распознает свою клетку-мишень по рецептору, находящемуся на поверхности лимфоцитов, для чего задействуется поверхностный гликопротеин вируса gp120, лиганд рецептора – очень ограниченный входной билет для вируса.

Разрабатываются альтернативные подходы. Один из них заключается в изоляции опухолевых клеток, лечении их вне организма, получении в лабораторных условиях большего количества излеченных и подвергнутых соответствующей обработке клеток и последующем их возвращении в организм пациента. Такой метод ex vivo является более безопасным и эффективным, чем терапия invivo.

Интеграция любого ретровируса всегда опасна, поскольку сайты интеграции возникают произвольно, а их модификация может нанести ущерб или повредить клеточные гены. Это явление называется «инсерционный мутагенез» или «инсерция промотора» (имеется в виду сильный вирусный промотор), что может привести к развитию рака. Таким образом, лекарственные препараты могут вызвать рак. Именно это наблюдалось у некоторых детей с иммунодефицитом. Алан Фишер из Парижа лечил 18 детей, используя ретровирусный вектор, который экспрессировал фактор роста для терапии наследуемого иммунодефицита, «аденозиндезаминазной недостаточности». Из-за этого дефицита пациенты становятся настолько восприимчивыми к инфекции, что вынуждены жить в стерильных условиях. Применение генной терапии привело к излечению 16 пациентов, но вместе с тем и к развитию опасного инсерционного (вставочного) мутагенеза у оставшихся двух пациентов, причем вирусный промотор индуцировал у детей лейкемию (к счастью, это состояние можно контролировать). Таким образом, генная терапия ex vivoсопряжена с определенным риском.

Еще одним шагом вперед является разработка индуцируемых ретровирусных векторов. Их по желанию можно включать и выключать путем добавления или удаления регуляторных соединений (например, антибиотика тетрациклина). Таким образом можно повлиять на активность вируса или даже контролировать дозу продуктов, содержащих терапевтические гены. Это может снизить токсичность и прочие побочные эффекты. Некоторые рекомбинантные вирусы после выполнения своих функций самоуничтожаются за счет так называемого процесса «самоинактивации» (SIN).

Существуют индуцированные интерфероном гены, которые мой коллега Йован Павлович (студент Джина Линденманна, ученого, открывшего интерферон) разработал в Институте медицинской вирусологии (Цюрих). Это стало предметом интенсивных исследований Фонда Volkswagen, проводимых на модели выводимых трансгенных мышей. У этих мышей с помощью интерферона можно включать и выключать гены. Для разведения таких мышей требуется около трех лет, и для моих коллег это было не очень привлекательно. Между тем разработан новый и высокоэффективный способ – CRISP/Cas9. В настоящее время выращивание таких мышей – дело нескольких недель.

Понимание механизма формирования опухоли до сих пор остается исследовательским проектом, особенно что касается модели трансгенных мышей. Остается открытым вопрос, как онкогенные белки Ras и Myc комбинаторно индуцируют развитие опухоли? В 2015 г. этот вопрос все еще оставался без ответа, несмотря на то, что уже более 30 лет известно, что тандем этих двух онкогенов является выраженным «возбудителем» рака. Это крайне удивительно. У мышей два этих сильных онкогена не обязательно вызывают развитие рака, и никто не знает, почему так происходит. Каких факторов не хватает? Это ставит под сомнение использование мышей в качестве животной модели для изучения опухолей.

Для использования в целях генной терапии помимо ретровирусов разрабатываются аденовирусы. Их преимущество заключается в способности инфицировать большое число разных типов клеток-хозяев и не интегрироваться, что обусловливает отсутствие генотоксического побочного эффекта. Их можно выращивать до высоких концентраций – 1011 вирусов на 1 мл, для достижения более выраженного терапевтического эффекта. В 1999 г. в Филадельфии, в начале эры использования генной терапии молодому пациенту с нетерминальной стадией заболевания проводили генную терапию с использованием аденовирусов. Врачи назначили ему до 1015 вирусных частиц в надежде, что чем выше доза, тем лучше окажется результат. Но произошло обратное: мальчик Джесс Гельсингер умер от избыточной реакции иммунной системы, так называемого «цитокинового шторма», поскольку у него уже выработались собственные антитела против терапевтического вируса. Вся область генной терапии испытала потрясение, а ведущий исследователь был отстранен от обязанностей. Исследователи извлекли из этого случая следующий урок: лечение терапевтическими вирусами следует назначать пациентам, ранее не получавшим соответствующие препараты, то есть не имеющим антител к таким вирусам.

Большинство людей всю жизнь сталкиваются с аденовирусными инфекциями без вреда для здоровья и являются носителями антител, в частности антител, которые вступают в противоречие с этой терапией. Поэтому в настоящее время врачи назначают аденовирусы не человека, а скорее приматов, поскольку большинство людей с ними не сталкивается. До недавнего времени использовали адено-ассоциированный вирус (ААВ). Выбор пал именно на этот вирус по причине его способности специфически интегрироваться на одном сайте хромосомы 19, то есть была исключена неспецифическая интеграция и все сопряженные с ней риски. К сожалению, вектор ААВ часто теряет именно это преимущество, но тем не менее его продолжают разрабатывать как многообещающий вектор.

В исследовании рака в последнее время лидерами являются онколитические вирусы, которые инфицируют, реплицируются и лизируют только опухолевые клетки (о чем свидетельствует их название). В нормальных клетках репликации не происходит, и они остаются здоровыми. Кроме того, убитые опухолевые клетки высвобождают большое количество вирусов. Поэтому такой подход позволяет решить вышеупомянутую проблему – репликацию дефектных вирусов. Возможна инъекция онколитических вирусов, после чего они находят опухоль или метастатические клетки в организме. К тому же сам по себе вирус является стимулом для иммунной системы в качестве дополнительной иммунной терапии. Уже продолжительное время появляются сообщения о единичных случаях излечения в результате применения «виротерапии», при которой на фоне неспецифических вирусных инфекций или применения вакцин отмечалось улучшение симптоматики не связанных между собой заболеваний. Данную терапию не понимали и в один прекрасный момент забросили, но сейчас она возвращается как один из компонентов терапии с использованием онколитических вирусов.

Использование онколитических вирусов против раковых клеток – оригинальный подход, который изучается во многих лабораториях. Фрэнк Маккормик разработал его примерно 20 лет назад в своей компании Onyx, используя генетически модифицированные аденовирусы, которые реплицируются и лизируют только опухолевые клетки, несмотря на то, что инфицируют и нормальные клетки, в которых не могут реплицироваться как обычно. Фокус заключается в том, что терапевтический вирус становится чувствительным к супрессорам опухоли в нормальных клетках, чего в любом случае не происходит в самих раковых клетках.

А между тем в настоящее время проводится примерно 20 клинических исследований, даже в относительно безнадежных случаях, в частности при опухоли головного мозга и поджелудочной железы. Несколько лет назад в Китае разрешили к применению препарат для лечения рака головы и шеи. 2016 г. – ориентировочный срок выдачи регистрационных удостоверений на препараты для терапии злокачественной меланомы. В Немецком центре исследований рака в Гейдельберге разрабатывается метод с использованием вирусов кори. Возможно использование и других вирусов, в частности парвовирусов, полиовирусов или модифицированных герпесвирусов, которые являются онколитическими. Давайте надеяться и верить, и посмотрим, что произойдет.

Биофармацевтическая компания Amgen обогатилась в результате продажи эритропоэтина, который индуцирует репликацию предшественников эритроцитов. Наряду с узаконенным применением эритроциты зачастую используются в спорте в качестве допинга. Amgen приобрела Onyx за несколько миллиардов долларов и является первой компаний, получившей разрешение на работу с онколитическими вирусами.

Onyx занимается разработкой ингибиторов киназы Raf для лечения рака прямой кишки. Недавно она получила внушительный грант на разработку онкогена Ras – направление, где еще никому не удалось добиться успеха, несмотря на огромные расходы и десятки лет, потраченные многими фармацевтическими компаниями. Мутированный Ras – один из наиболее часто встречающихся онкогенов при раке, но у него так много нисходящих мишеней, что любое лечение, предусматривающее использование этого онкогена, до сих пор было сопряжено с побочными явлениями. Потребуются комбинации различных лекарств – двойная или тройная терапия.

«Крупные фармацевтические компании поглощают мелкие биотехнологические фирмы» – это стало новой стратегией. Она приемлема для мелких фирм, которые не могут разработать препараты для клинического применения и выполнить все нормативные требования, притом что затраты составляют миллиарды долларов. Поэтому мелкие биотехнологические компании предпочитают, чтобы их поглотили крупные фармацевтические фирмы, и рассматривают это как рентабельную стратегию, дающую быстрый результат. Мелкие компании отличает более выраженная инновационность, способность проводить более гибкую политику, бóльшая готовность и способность рисковать, выигрывать и проигрывать, в то время как крупные компании претерпевают «мутации», превращаясь в инвестиционные институты, которые ограничивают объем научных исследований, – вероятно, сейчас достаточно просто отслеживать новые разработки на рынке, чтобы принимать обоснованные решения по вопросу поглощения соответствующих компаний!

Начинания Фрэнка Маккормика неоднократно приводили к успеху. Он был основным докладчиком на первой конференции по биотехнологиям, которую я организовала в Цюрихском университете. Я знаю его с тех пор, как стала исследователем в Обществе Макса Планка в Берлине, а он работал по совместительству в американской биотехнологической компании. Мои цюрихские коллеги сетовали на то, что не были первыми! Когда я организовала это мероприятие, все очень боялись биотехнологий, опасались влияния коммерции на науку, что предусматривает вовлечение в этот процесс денег и пациентов. Наука привыкла быть открытой для огласки, свободной, не связанной никакими ограничениями, а неразглашение результатов исследований считалось неприемлемым. Помню, как в новой форме заявки на грант Швейцарского национального научного фонда появился последний пункт: «Как вы планируете использовать результаты своих исследований на практике?» Мои коллеги не понимали сути вопроса, так как совершенно не думали о применении результатов своей работы в разработке препаратов! В то время об этом ничего не знали в области биомедицины, но в инженерии и химии это уже стало нормой. В настоящее время любой человек практически в любом университете может ежегодно участвовать в конкурсах для отделившихся компаний на получение поддержки. Учрежденная Маккормиком биотехнологическая компания была одной из наиболее успешных. Мы учились у него, но, вероятно, не настолько усердно, чтобы стать такими же успешными.

Дверь с нарушенной герметичностью, липицианские лошади и шейхи, а также «опубликовать или сгинуть».

В Филадельфии (США), будучи директором по науке в биотехнологической компании Apollon, я руководила разработкой вакцины против ВИЧ. Она была основана на новом принципе – использовании «голых» плазмидных ДНК («голая» – это ДНК без белковой оболочки или упаковки в частицы). В 1990-х гг. эту вакцину испытывали на ВИЧ-инфицированных добровольцах из Цюриха (Швейцария) и Филадельфии (США). Вакцина представляет собой ДНК-плазмиду, кольцевую двухцепочечную ДНК, осуществляющую перенос генов в мышцы. Она имитирует вирусную инфекцию у пациента и приводит к образованию антигенов ВИЧ, после чего, как мы надеялись, начнется формирование защитных антител. Это была первая вакцина подобного рода в Европе. Три года она не давала никаких побочных действий. Безопасность чрезвычайно важна для вакцины, поскольку она, как правило, вводится здоровым и молодым людям. Мы ввели одному пациенту «не ту» вакцину от ВИЧ, которая не соответствовала штамму его инфекции. Сначала мы были в шоке. Однако фаза I клинического исследования предусматривает тестирование лишь безопасности, а не эффективности вакцины, поэтому это было не столь важно, но мы все равно оказались в несколько затруднительном положении. В настоящее время данная вакцина в комбинации с другой вакциной против ВИЧ исследуется в вооруженных силах США, поскольку ДНК-вакцина сама по себе не очень эффективна.

Кроме того, мы применили этот подход к раковым пациентам, страдающим злокачественной меланомой, и вводили ДНК (кодирующую интерлейкин-12) в место нахождения опухоли, что обусловливало экспрессию иммунного стимулятора в качестве поддержки иммунной системы пациента для борьбы с меланомой. Мы отметили существенное уменьшение размера опухоли у мышей и даже у белых лошадей. Регуляторные органы требуют использования двух животных моделей. Мы выбрали белых лошадей, поскольку они заболевают злокачественной меланомой, но не погибают от нее. В результате нашего лечения отмечалось сокращение опухоли, и животным удавалось избежать бойни. После этого нас пригласили на конезавод в Пибере (Австрия), где разводят липицианских лошадей, выступающих в венском дворце Хофбург. Однако мы можем лишь уменьшить отдельные опухоли, но не в состоянии предложить системное лечение, что, как ни грустно признавать, не вполне хороший результат.

Препараты, применяемые для лечения пациентов, должны соответствовать требованиям надлежащей медицинской практики (GMP), в силу чего производство становится очень дорогостоящим (примерно $1 млн). Это всегда проблема при разработке новых терапий. Компания Berna (Берн, Швейцария) любезно предоставила препарат, но производила она его дважды – поскольку в первый раз сотрудники не закрыли дверь как следует. Потеря времени и денег, но правила нужно выполнять. У некоторых пациентов размер опухоли уменьшился, а одному даже удалось спасти ногу от ампутации. Испытывая определенную гордость за полученные результаты, мы пришли в Hoffmann-La Roche, которая утверждала, что имела патентные права. К нашему разочарованию, Hoffmann-La Roche не была заинтересована в последующем наблюдении за пациентами. Она и ранее использовала это соединение в концентрации, в 1000 раз превышающей исследуемую нами дозировку, и выяснила, что она смертельна для пациентов. Мы знали о высокой концентрации и не использовали ее. Но даже при этом никому больше не хотелось связываться с данным препаратом.

Позднее, как это ни странно, возникли новые проблемы: клинический исследователь пренебрег установленными возрастными рамками при отборе одного из 12 пациентов – всего-то на несколько лет, но этого было достаточно, чтобы возникли проблемы со швейцарскими регуляторными органами. Исследователь сделал это в интересах пациента, но при этом нарушил протокол исследования и получил строгий выговор. Не сдавайте на анализ каплю слезы, слюны, семенной жидкости или мочи пациента без разрешения этического комитета! В этой области действуют строгие правила. (Недавно мы использовали семенную жидкость, полученную анонимно от коллег-ученых для тестирования эффекта бактерицидного средства, которое пытаемся разрабатывать, – нам потребовалось несколько месяцев, чтобы уладить этот вопрос с регуляторными органами и представить полученные результаты для последующей публикации.).

Затем одному коллеге понравились результаты наших клинических исследований рака кожи, и он предложил соответствующую терапию шейхам из Арабских Эмиратов, не поставив нас об этом в известность, как будто мы не числились изобретателями. Этот факт стал предметом гласности, и наши контакты с этим коллегой прекратились – очень печально, поскольку мы могли бы лечить людей. Вместо этого началась борьба за авторские права. Для урегулирования этого вопроса университет назначил «посредника» (я до этого даже не знала о существовании таких специалистов!). Я потратила чудесный летний вечер, разбирая стопку протоколов ведения пациентов и полученные данные, чтобы самой скомпоновать их для публикации. И это сработало, но не привело к продолжению исследований, поскольку за это время требования, разработанные Европейским агентством по оценке лекарственных препаратов (EMEA), слишком ужесточились и проведение таких клинических исследований с участием ученых, как наше, стало слишком дорогостоящим. В будущем все анализы пациентов должны оплачиваться отдельно, так же как и работа клинических исследователей и медсестер, примерно $100 000 на каждый случай. Безнадежное дело. Кроме того, в берлинской клинике «Шарите» нам не удалось договориться о более низкой цене. Мы потратили четыре года впустую. С тех пор «драгоценное» соединение, разработанное в соответствии с положениями GMP, которые обусловливают серьезные финансовые затраты, хранится в холодильнике, отвечающем требованиям безопасности, поскольку я не решаюсь выбросить его.

Вероятно, стоит упомянуть, что новые вакцины против вируса Эбола и Зика, которые разрабатываются в наше время, основаны на этом типе ДНК-вакцин, поскольку все, что нужно, – это знание последовательности вируса, возможность синтезировать ДНК пациента и некоторый опыт в области биотехнологии. Кроме того, вакцины часто обладают довольно слабовыраженными иммуногенными свойствами, и может возникнуть необходимость в дополнительных иммуностимулирующих компонентах. Однако они безопасны, стабильны, удобны в транспортировке и их можно хранить в отдаленных местах.

А что касается публикаций, некоторые читатели могут задаться вопросом: «Действительно ли они так важны?» По публикациям судят об успешности ученого, и при рассмотрении заявок на выделение фондов этот фактор принимается во внимание. Оценка качества статей зачастую основана на крайне спорных критериях. Качество статьи во многих случаях гарантируется престижностью журнала, который принимает ее в печать после критического анализа анонимными рецензентами, чьи имена никогда не раскрываются (есть очень незначительное число журналов, которые пытаются изменить эту политику, внедрив вместо нее «практику открытого рецензирования»). Часто на рецензирование уходит год, и вполне возможно, что за это время ваши коллеги уже уволятся, а предмет исследования группы изменится, что также может привести к возникновению проблем. Существует рейтинг журналов, основанный на так называемом рейтинге цитируемости со шкалой от 1 до 60, который отражает среднее число ссылок за год в других статьях на опубликованный материал. В этом рейтинге самые высокие позиции занимают Nature, Cell, Science и еще несколько медицинских журналов. О качестве статьи свидетельствует «указатель ссылок в научной литературе». Журналы обнародуют эти цифры, чтобы побудить ученых публиковать статьи именно у них («h» – показатель или индекс Хирша, означающий число ссылок на автора, который используется реже). Эта информация указывается в заявке на замещение вакантных должностей от постдокторанта до профессора и является в том числе основанием для выделения средств на проведение исследований. Нет большего счастья, чем получить из рук доктора Милдред Шеель очень внушительный «основной грант» на исследование рака. Эта дама была супругой бывшего федерального президента ФРГ и основателем Немецкого фонда помощи больным раком и, как это ни печально, сама умерла от рака. Мне повезло получить чек на проведение исследования ВИЧ из рук швейцарского банкира после телеинтервью – со мной это однажды произошло. При этом я не заполнила ни одной заявки на получение гранта.

Приведу несколько цифр: много лет я заполняла до восьми заявок в год, исходя из того, что каждое из исследований будет профинансировано на 50%, то есть примерно $200 000 или $300 000. Любая статья в моей области исследований стоит более $600 000 и в среднем требует двух лет интенсивных исследований. Налогоплательщики финансируют существенную часть расходов на наши исследования – мое хобби! И я им за это очень благодарна.

Чтобы получить должность профессора, нужно иметь 50–100 публикаций, в том числе в нескольких очень престижных журналах, а также вести исследования в перспективных областях. Для хабилитации (так в немецкоговорящих странах называется квалификация для преподавания в университете) требуется, чтобы претендент на должность имел 15 публикаций, в списке авторов которых он указан либо первым, либо последним. Ранее женщинам для назначения на должности профессорско-преподавательского состава требовалось больше публикаций, чем мужчинам, но в настоящее время для получения профессорской должности им нужно представить меньше публикаций! Список авторов статей редко составляется в алфавитном порядке, что часто наблюдается в физике. Первой указывается фамилия ученого, внесшего наиболее существенный вклад в исследование, а фамилия руководителя группы ученых – последней. Финансирование исследований более не рассматривается как соавторство. Руководитель больше автоматически не считается наиболее значимым автором, его фамилия стоит последней. Все указанные авторы должны разбираться во всех приведенных в статье данных и отвечать за их точность, а не только в той части материала, которую они подготовили для статьи, – это недавно введенное требование, призванное сократить случаи мошенничества среди ученых! С некоторых пор стало принято указывать вклад каждого автора в работу, а в конце материала помещать информацию о том, какой интерес изложенная информация может представлять с коммерческой точки зрения. Советую делать еще одно заявление: авторы должны подтвердить, что работали с литературой должным образом. Это крайне «полезно» (при недобросовестном поведении ученых), чтобы авторы не забывали упомянуть о вкладе в исследование проблемы какого-либо ученого-конкурента в надежде на то, что рецензенты это не обнаружат, – и все для того, чтобы обеспечить публикации незаслуженно высокий рейтинг как материалу, содержащему новые результаты. Я уже упоминала несколько таких случаев, с которыми мне приходилось сталкиваться. Для сотрудников университетов вопрос, касающийся получения грантов, очень важен. Им приходится задействовать все источники для финансирования исследований, и нередко в этом участвуют некоторые университетские структуры. Финансовая поддержка со стороны коммерческих компаний всегда вызывает некоторое беспокойство. Кроме того, оценивается качество преподавания, и часто это определяется путем проведения голосования среди студентов, а затем в игру вступает счастливый случай. После того как удачный выбор сделан – и сделан в вашу пользу, я никому не пожелаю испытать на себе месть тех, кого вы обошли: эти люди зачастую лучше разбираются в университетской инфраструктуре, в том, как функционирует локальная компьютерная сеть, и у них больше времени на «боевые действия». По крайней мере так было в моей жизни: дискриминация, анонимки с ложной бездоказательной информацией и прямые угрозы даже от высокопоставленных «коллег», удостоенных самых высоких премий и наград. Я знаю, о чем говорю, и желаю, чтобы вам повезло больше, чем мне.

«Вакцинация комаров» для борьбы с вирусами.

Недавно мишенью генной терапии стали комары. Я имею в виду вовсе не тех комаров, которые досаждают нам теплыми летними вечерами, когда мы собираемся на барбекю на берегу какого-нибудь озера или водоема со стоячей водой. Они, как правило, не опасны. А вот другие опасны! Один из таких видов – «комар желтой лихорадки» (Aedes aegypti), который является переносчиком вируса лихорадки денге (DFV) и других вирусов – возбудителей лихорадки Западного Нила (WNL), желтой лихорадки и вируса Чикунгунья. Недавно был открыт еще один флавивирус – тот самый вирус Зика. Вышеупомянутые виды комаров живут в жарком и влажном климате, поэтому нам, жителям Северной Европы, нечего опасаться. Однако родственника вышеупомянутых комаров, полосатого тигрового комара (Aedes albopictus), выявили во Франкфурте как переносчика инфекции.

Случайно было установлено, что комары, инфицированные бактериями, могут вырабатывать противовирусные субстанции, способные уничтожать вирусы (бактерии, вероятно, являются носителями фагов, необходимых для продуцирования токсина). Такую комбинацию нужно вводить комарам. Но как это сделать? Путем микроинъекций – звучит совершенно нереалистично. Действительно нетривиально при работе с комарами, но это уже сделали. Есть надежда, что количества насекомых, которым провели такие манипуляции, окажется достаточно и их численность превысит численность других комаров. Однако такие «дизайнерские насекомые», как правило, растут медленнее. Тем не менее проект «Вольбахия», предусматривающий использование «дизайнерских комаров» и направленный на борьбу с вирусом лихорадки денге, получил поддержку Фонда Билла и Мелинды Гейтс. Кроме того, заинтересованность в нем выразил ряд других стран – Вьетнам, Таиланд, Индонезия и Бразилия, а также армия США для защиты военнослужащих, пострадавших во время Вьетнамской войны. Ежегодно вирусом заражается 50 млн человек, из них 600 – в Германии. Появилась новая тенденция: тигровые комары попадают в Германию из Южной Европы через Швейцарию, а далее на север, чего не случалось ранее и что обусловлено глобальным потеплением. Известно четыре вида вирусов лихорадки денге, при этом вторичная инфекция повышает риск развития тяжелой формы вторичной реакции, в частности геморрагической лихорадки, которая может привести к летальному исходу. Используется термин «вакцинация комаров», но это определение не вполне верно. Речь идет не о вакцинации, а об инфицировании комаров бактериями, содержащими токсин-продуцирующие фаги (запомните – энтерогеморрагический штамм кишечной палочки EHEC!). Это простой и дешевый способ, не нужно никаких пестицидов, к которым у вирусов может вырабатываться резистентность. Результаты проведенных в Австралии экспериментов представляются весьма многообещающими.

В настоящее время используются генные манипуляции для получения стерильных самцов, которые спариваются с самками, не давая при этом потомства. В этом случае популяция должна вымереть. Это называется методом стерилизации насекомых. К сожалению, стерилизованные самцы ленивее самцов в дикой природе! Или же они могут использоваться для переноса яда и называются «ген комара». Гены самцов влияют на самок таким образом, что они производят только самцов, что также обусловливает прекращение производства потомства. В настоящее время исследуется грибок, используемый для уничтожения личинок комаров. Интересно, какая из этих фантастических разработок, помимо распыления пестицидов, поможет нам в борьбе с вирусом Зика?

Важно отметить, что пестициды используются часто, но в долгосрочной перспективе от этой практики откажутся. Бактерия Bacillus thuringiensis (Bt), являющаяся носителем ДНК плазмиды токсина, в настоящее время разрешена в ЕС для использования в качестве пестицида, поскольку яд полностью биоразлагаемый, но вместе с тем к ней развивается резистентность.

Комары обитают в емкостях с дождевой водой, бочках с водой, вазах для цветов на кладбищах. В настоящее время тестируется новый подход к проведению полевых исследований в Европе, своего рода проект гражданской науки, в рамках которого добровольцев просят собирать комаров и присылать их для исследования. Такой проект позволит нам получить ответы на важные эпидемиологические вопросы, касающиеся миграции комаров, в частности, мигрируют ли они севернее Франкфурта?

Для борьбы с комарами Anopheles – переносчиками малярии, используется такой же подход, что и против тигровых комаров.

С недавнего времени вакцинация одним из белков вируса лихорадки денге (DFV) тестируется на мышиной модели. В состав этой вакцины входит рекомбинантный неструктурный белок (NS1) вируса лихорадки денге, и вакцина защищает мышей от вируса. Было установлено, что этот белок вызывает «протечку» кровеносных сосудов. Вполне возможно, что это обстоятельство долго оставалось незамеченным.

Весьма вероятно, что после вспышки вируса Эбола в 2015 г. и решений, принятых на саммите «Большой семерки» в Эльмау (Германия), разработка вакцин от тропических заболеваний и, возможно, от вируса Зика ускорится. Синтез и производство ДНК-вакцин не требует много времени, но эти вакцины нуждаются в дополнениях.

Вирусы для лечения растений.

Как прокормить население Земли в будущем? Сто лет назад Фриц Габер из Берлина разработал метод фиксации азота и производства удобрений, незаменимых сегодня при производстве продуктов питания. Для выживания человечества нужно еще одно такое изобретение. Являются ли генетически модифицированные организмы этим будущим? У нас есть генетически модифицированные помидоры и кукуруза, которые европейские потребители в теории отказываются приобретать, но на практике покупают их, поскольку эти продукты дешевле. Как долго мы можем себе позволить от них отказываться? ЕС разрешил использовать кукурузу, обработанную Bacillus thuringiensis (Bt), носителем гена-токсина против насекомых, и опубликовал это решение. Кроме того, существует гербицид-резистентная кукуруза, которая не поражается при использовании гербицидов. Есть также сорта картофеля с высоким содержанием крахмала, предназначенные для промышленных целей, а не для пищи. Такой картофель даже разрешен для использования в качестве генетически модифицированных организмов или рекомбинантных продуктов. С недавнего времени ЕС более не занимается этим вопросом, теперь каждая страна сама решает, как ей поступать с ГМО. Следует помнить, что орошение клубней картофеля фагами повышает его урожайность в пять раз. Является ли это вариантом производства продуктов питания без ГМО? Я бы предпочла такой вариант.

Для генной терапии растений используют специальные бактерии, вызывающие развитие опухоли у растений. Как это ни странно, но у растений могут возникать опухоли. На самом деле это результат действия бактерий Agrobacterium tumefaciens[19] (очень говорящее название), которые индуцируют развитие «корневого рака» у растений. Инфицирование бактериями осуществляется за счет фагоподобной ДНК, опухоль-индуцирующим Тi-плазмидами. Эти кольцевые ДНК-плазмиды не интегрируются в геном и индуцируют развитие опухолей. Известно, что специалисты по генной терапии совершают обратный процесс, замещая опухолевые гены терапевтическими. Так ретровирусы с онкогенами становятся вирусами с терапевтическими генами. Аналогичным образом опухоль-индуцирующие гены замещаются терапевтическими генами, в частности токсин-продуцирующими генами в Ti-плазмидах, направленными против паразитов, живущих в растениях. Такие генетически модифицированные организмы вызывают опасения у многих фермеров и потребителей, а регуляторные органы заняты разработкой соответствующих норм и правил. В США около 80% всего объема выращиваемых сои, хлопка и кукурузы – генетически модифицированные растения, характеризующиеся повышенной урожайностью. Новый проект Трансатлантического торгового и инвестиционного партнерства мог бы существенно повлиять на практическое применение таких продуктов.

А теперь я приведу шокирующую информацию: ГМО-кукурузой кормили крыс, и в течение двух лет это привело к развитию у них опухоли. Мы совершенно этого не ожидали, несмотря на то, что Тi-плазмиды оправдали свое название и обусловили возникновение опухоли у крыс. В силу этого в зоне риска оказалась не только ГМО-кукуруза, но и вся система, используемая для целей генной терапии, то есть Ti-плазмиды в качестве носителей терапевтических генов. Вместе с тем невозможно сразу понять, возникнет ли у человека проблема, аналогичная той, что наблюдалась на модели крыс. Возможно, крыс перекармливали, давая им слишком много корма одного вида. Такое вполне может быть, но это стандартное исследование, проводимое при разработке препаратов, когда определяется «максимально переносимая доза». Столько есть никто не будет. В таком случае опасно ли потребление небольшого количества ГМО-кукурузы? Исследование максимально переносимой дозы включает в себя анализ риска для детей, пожилых людей и людей с ослабленным здоровьем. Можно ли в качестве альтернативы сократить дозировку терапевтических генов в кукурузе? Это хороший вопрос. Возможно, селекционеры переборщили с токсинами.

Публикация материала о крысах, у которых кукуруза вызвала развитие опухоли, породила скандал. Люди, не согласные с приведенными в статье выводами, отмечали, что статистические данные неубедительны, что для исследования было использовано слишком мало животных, что имеющихся данных недостаточно для опубликованных заключений. Авторов статьи попросили ее отозвать. Но они отказались и аргументировали это тем, что рукопись прошла научную оценку, с ней работали рецензенты и ее приняли в печать. Зачем же им задним числом от нее отказываться? А между тем дискуссия продолжалась и высказывались замечания относительно того, что были не замечены очевидные ошибки, и наконец издательство заявило об отзыве уже опубликованной статьи. В чем же там было дело? В данных? В статистике? Были ли рецензенты недостаточно компетентны? Какой-то этап подготовки материала к печати оказался без должного контроля! Это был уникальный случай. Что же осталось за кадром? Имело ли место давление с чьей-то стороны? Что это: наука или коммерция? Потребители были настроены весьма скептически.

Самый новый по времени подход, предусматривающий модификацию генов и реверсирование болезней, основан на методе CRISP/Cas9, существующем у бактерий с противовирусной системой защиты от фагов. Гены можно модифицировать только на очень короткий период времени, пусть – и это интересно – не путем вставки или рекомбинирования части ДНК, а задавая «направляющую» последовательность, но у клетки появляется возможность осуществить соответствующую корректировку путем считывания «направляющей» последовательности, что называется «редактирование». В соответствии с законодательством, регулирующим ГМО, использование технологии рекомбинации не допускается. Необходимо ли новое законодательство для этой новой технологии? До тех пор, пока оно не появится, может быть разработано большое количество модифицированных организмов! Я полагаю, что соответствующие органы пока еще не заметили этот недостаток!

Способны ли вирусы спасти каштановые деревья и бананы?

Каштановые деревья погибают от грибка. Можно ли их спасти? Могут ли вирусы помочь в предотвращении их гибели? В Нойштадте-ин-Хольштайн (Северная Германия), городе моего детства, вырубили все столетние вязы, и сразу стала видна огромная рыночная площадь, «обнажился» готический собор из красного кирпича, реальные размеры которого ранее никто особенно не замечал. Кроме того, опустели аллеи вдоль балтийского побережья, потеряв весь свой шарм. На площади Вогезов, Пале-Рояль, авеню Паризине – все парки вырублены. В 1977 г. спилили погибший «вяз Наполеона» (посаженный в год рождения Наполеона), хотя срез его ствола хранится в одном из боннских музеев. Все дубы исчезли. Теперь очередь буков? Что вызвало гибель вязов? Переносчиками этого грибка являются жуки, расщепляющие кору. Они выламывают кусочки древесины и пробуравливают путь внутрь ствола, занося туда споры грибов. Личинки жуков роют ходы и каналы внутри ствола, где токсины грибов начинают «работать». Они закупоривают каналы, по которым циркулирует сок дерева, из-за чего вода и питательные вещества не могут по ним подниматься, и деревья начинают «задыхаться». Этот грибок появился в начале XX в., был завезен из Азии сначала в США, а потом в Европу, и причинил большой ущерб. Может быть, грибы прятались в скоплениях воды в старых автомобильных шинах во время их транспортировки в Европу? Есть несколько историй в пользу этого предположения. Что можно сделать, кроме как вырубить деревья? Та же история с погибающими каштановыми деревьями. Эта болезнь называется «каштановая гниль» (или, более научно, эндотиевый рак коры каштана съедобного). В США она появилась 100 лет назад и уничтожила 4 млрд деревьев – целые леса. Каштановые деревья – символ восточного побережья США. Фан-клубы и защитники деревьев начали предпринимать определенные действия и попытались спасти каштановые деревья. Грибок Cryphonetria parasitica,или сокращенно C. parasitica, завезли из Китая в 1904 г. Независимо от того, дело в жуках или не в них, прогрызают они ходы или нет, этому грибку удается уничтожать деревья метровой толщины. Птицы, насекомые, капли дождя или ветер способны переносить споры на следующее поколение деревьев-жертв. Чтобы остановить это бедствие, испробовали все средства – фунгициды, сернистый газ, облучение, даже проводили какие-то ритуалы. Возможно, майя точно знали об этой сельскохозяйственной проблеме и приносили человеческие жертвоприношения, чтобы задобрить своих богов.

В Австралии неожиданно появился новый вид «супербактерий», а переносчиками их являются китайские клещи, для предотвращения распространения которых были приняты все меры предосторожности: в пределах досягаемости вырубили все клены. Я была свидетелем этого бедствия в 2015 г. Клещей завезли в палетах. Упаковочный материал должны были предварительно продезинфицировать, но не сделали этого. В настоящее время собак натаскивают на распознавание запаха этих жуков.

В Китае каштановые деревья обладают устойчивостью к этому грибку, поэтому их геном секвенировали и выделили ген, отвечающий за эту резистентность. В настоящее время данный ген передается бактериям A. tumefaciens при помощи Ti-плазмиды. Кроме того, в плазмиде клонировали яд жабы, и ожидается, что он уничтожит грибок. В список генов, предназначенных для горизонтального переноса генов Ti-плазмидами, включены гены горького шпината.

Швейцарские ученые разработали генную терапию для каштановых деревьев, для чего использовали вирус hypovirus, парализующий грибок, обитающий в дереве. Этот странный вирус относительно неизвестен (он состоит из «голой» двухцепочечной РНК, у которой нет оболочки, а только один или два кодирующих гена, и он специфичен против грибка). К сожалению, вирус развивается только внутри грибка и перемещается из грибка в грибок. Поэтому для лечения деревьев используется грибок, инфицированный вирусом. Хочется надеяться, что вирус попадает в интактные грибки и уничтожает, и хорошо бы все сразу! К каждому дереву нужен индивидуальный подход, то есть персонифицированная медицина для деревьев. Это слишком сложно и громоздко даже для швейцарских защитников природы. Китайские исследователи пытаются аналогичным образом защитить кукурузу и виноградные косточки от грибковой инфекции путем распространения грибка, инфицированного вирусом. Кроме того, обрабатывают и корни.

Тем не менее самый надежный подход – использование традиционных методов селекции, скрещивание китайских каштанов, резистентных к грибку, с американским видом этих деревьев, находящихся в опасности. Для формирования устойчивости у американских деревьев достаточно 6% китайских генов. Но даже в этом случае они не слишком похожи на китайские каштаны – у них нет ворсистых листьев, которые не любят американцы. Но на это требуется время. У нас в Германии кора каштановых деревьев приобретает коричневый цвет, и нас это беспокоит. Однако, что касается этих деревьев, грибок сделал не слишком глубокие и опасные «ходы», поскольку он поражает только листья. Поэтому опадают только листья, а в целом дерево не погибает. Каштаны, растущие на площади Брайтенбах в Берлине, которые всегда расцветают в мае, подвергаются меньшей опасности. Берлину повезло: не нужно ждать генную терапию Ti-плазмидами с ядом или генами шпината. Есть старое доброе средство защиты от грибка – собрать осенью листья и сжечь их.

Бананы – очень важный продукт питания. Для них угрозу представляет грибок Sigatoka. Секвенированный геном банана оказался невероятно большим – 32 000 генов, больше нашего (около 20 000 генов), поскольку многие гены дуплицированы. Было выявлено всего несколько генов, отвечающих за резистентность к грибку. В Африке эти растения обрабатывают инсектицидами 50 раз в год, но это не помогает при данном заболевании (Fusarium oxysporum). Селекция и скрещивание невозможны, поскольку у этих растений бесполое размножение. Поэтому бактерия A. tumefaciens с Ti-плазмидами – единственная надежда, и в Африке эта методика уже тестируется. Тем не менее в глобальном масштабе присутствие бактерий в продуктах питания не очень хорошо воспринимается. Есть новый способ – использовать «пистолет» для введения Ti-плазмид непосредственно в растения, в этом случае не нужно применять бактерии для переноса генов. Есть вариант воспользоваться «генной пушкой», и однажды мы ее применяли при лечении рака, чтобы ввести ДНК-плазмиды пациентам непосредственно в мышцы. Терапия продемонстрировала некоторую эффективность. Шприцы с иглами оказались в наших руках более эффективными, и крайне дорогостоящая «пушка» вновь очутилась в своей дорого выглядящей коробке, выстланной красным бархатом, как ее поставил нам производитель.

К генетически модифицированным продуктам питания относится и рыба. Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) «вставили» в геном рыбы, и сейчас такие рыбы растут гораздо быстрее при меньшем объеме потребляемой пищи. Но никто не хотел есть такую гигантскую рыбу, так как она представляла собой практически одну сплошную большую опухоль, по размеру в 10 раз превышающую нормальную рыбу. В настоящее время фармацевтическая промышленность использует ее для тестирования новых терапий – если такие гигантские рыбы могут считаться релевантной животной моделью. «Генетически модифицированная пища» – предмет оживленной дискуссии. Лауреат Нобелевской премии немка Кристиана Нюсляйн-Фольхард провела публичное обсуждение вопроса о генетически модифицированных продуктах питания с профессиональным шеф-поваром. В 2016 г. она привела доводы в пользу генетически модифицированных продуктов питания как единственного способа обеспечить в будущем человечество едой. Недавно более ста лауреатов Нобелевской премии подписали петицию в пользу ГМО-продуктов, хотя необходимо провести дополнительные исследования и еще обеспечить прозрачность. И Кристиана Нюсляйн-Фольхард, и этот шеф-повар выпустили очень хорошие поваренные книги. Генетически модифицированные помидоры кладут в дешевый кетчуп, а научные противоречия потребителей не волнуют, просто такие продукты дешевле.

Нужно помнить о фагах.

Грибки: секс против вирусов.

А у грибков есть вирусы? Безусловно, есть! На планете нет форм жизни, не имеющих вирусов. В Цюрихе мой небольшой офис находится дверь в дверь с «лабораторией выращивания дрожжей» для стационарной диагностики. Они могут диагностировать «всего» около 1000 типов дрожжей, хотя на самом деле их миллионы. Один дерматолог отметил: «Большинство из них не делают нас больными». Опять одна и та же история: грибки, вирусы, археи и бактерии по большей части неболезнетворны. Безусловно, существуют некоторые патогенные грибковые инфекции. Временами это неприятно, и человеку хочется избавиться от грибка, если он проявляется во влагалище или под ногтевой пластиной. Они могут вызвать тяжелую форму легочной инфекции, которая ежегодно уносит 1,5 млн жизней в мире. Грибок вызывает развитие болезнетворной плесени в ванных комнатах, на потолке и в холодильниках, а также в охотничьих домиках в национальном парке Йосемити в США. Для борьбы с грибком нужен сквозняк или поток свежего воздуха и, естественно, ежедневная уборка квартиры. Разве не погибали археологи после того, как открывали вход в египетские пирамиды по прошествии нескольких тысяч лет со времени их строительства, вдыхая при этом споры грибков? В гробницах никогда не существовало вентиляции. Споры, используемые грибами для распространения, способны заразить зерновые культуры, и в средневековье это приводило к развитию «Антониева огня». На некоторых средневековых фресках Изенгеймского алтаря (Кольмар) изображены страдающие этим заболеванием люди, которые молят Бога о помощи. Грибковое заражение было обнаружено в орехах, арахисе, сухофруктах и специях. Комбинация вирусов и грибков, особенно это касается ядовитых афлатоксинов Aspergillus fumigatus, может представлять серьезную угрозу и вызывать развитие рака у человека.

Грибки также повлияли на политику, когда в Ирландии начался картофельный фитофтороз, что привело к Великому голоду в Ирландии в 1845 г. Тогда 2 млн ирландцев иммигрировали в США, а многие из оставшихся умерли от голода.

В странах Дальнего Востока герпесвирус, вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) в комбинации с грибком вызывает рак носоглотки, а в сочетании с вирусом гепатита В ведет к гепатоцеллюлярной карциноме – одной из форм рака печени. Афлатоксины, находящиеся на поверхности джемов или в хлебе, опасны для здоровья. Если этими токсинами поражены продукты питания, их нужно выбрасывать. Тем не менее мы нуждаемся в определенной подгруппе грибков – в одноклеточных пекарских дрожжах Saccharomces (S) cerevisiae – для выпечки хлеба, пивоварения и виноделия. И не стоит забывать, что грибки – источник антибиотика пенициллина.

Грибки довольно сложно классифицировать. Они относятся к эукариотам (организмам, содержащим оформленное ядро) и находятся ближе к более высокоорганизованным организмам, к животным, чем к растениям. Великий Карл Линней, создавший классификацию животных и растений, не знал, куда отнести грибки в своей системе. Они стоят особняком от других царств – растений, животных, простейших (протистов) и бактерий.

Грибки могут быть мелкими и одноклеточными, как, например, дрожжи. Вместе с тем они могут достигать самых крупных размеров, которые только наблюдаются у живых существ. Корневая система грибков бывает размером с футбольное поле и весит несколько тонн. Грибки отличает очень высокая кооперативность, и они формируют симбиоз практически со всеми растениями, помогая последним получать питательные вещества из почвы. Вместе с вирусами грибки обеспечивают устойчивость растений к высокой температуре, поэтому растения могут дольше выживать в условиях засухи. Вирус Curvolaria thermal tolerance virus (вирус термальной толерантности) существует в тройном симбиозе с грибком и растением, что позволяет растению выживать при 65 °С. Идея использования вирусов против глобального потепления должна привлечь внимание! Но об этом нужно говорить; возможно, они помогут сохранить ископаемые воды. Калифорнийские фермеры бурят скважины глубиной несколько тысяч метров и используют эту драгоценную воду для полива миндальных деревьев, несмотря на то, что запасы этой воды невосполнимы. В скором времени 4 млрд человек будут испытывать недостаток воды. Я больше не покупаю миндаль, поскольку для выращивания одного миндального ореха требуется 4 л воды.

Грибки могут существовать очень долго – до 2400 лет (возможно, внутри египетских пирамид?). Они образуют споры, что делает их самыми долгоживущими видами организмов на планете и, вероятно, вообще везде. У них наблюдается устойчивость к радиации, высокому давлению, невесомости, высоким и низким температурам. Возможно, они существуют на планете последние 1,5 млрд лет. Споры были «запаяны» в янтаре 30 млн лет, и недавно некоторые из них оживили, если это утверждение соответствует правде. Некоторые скептики этому просто не верят и подозревают, что это могло быть результатом контаминации в лаборатории. На борт космического корабля «Аполлон-12», отправленного на Луну, случайно попали споры, оказавшиеся в коробке из пенополистирола. Они вернулись в целости и сохранности, несмотря на воздействие на них невесомости и космических лучей, которые, как известно, оказывают мутагенное действие на генетический материал.

Еще в 1966 г. для секвенирования выбрали пекарские дрожжи, поскольку в их небольшом геноме содержится всего 13 млн нуклеотидов. Публикация об этом называлась «Жизнь с 6000 генов» (у нас 20 000 генов). Эти 6000 генов распределены по 16 хромосомам. Пекарские дрожжи и человек имели общего предка, но разошлись в развитии примерно 1 млрд лет назад, однако и сейчас у нас несколько тысяч схожих генов. Около 25% генов пекарских дрожжей родственны генам человека. Поэтому дрожжи использовали в качестве модели эукариотов. Онкоген Ras, известный по ретровирусам, имеет родственника в геноме дрожжей; его охарактеризовали и выявили некоторые различия. В настоящее время гены дрожжей один за другим заменили почти на 500 генов человека в новой области исследований, называемой синтетической биологией. Несмотря на существенное различие последовательностей, было установлено, что они выполняют аналогичные (ортологические) функции в цепочках метаболических путей. Это удивительно. Дрожжи будут использоваться в качестве «микролаборатории» для производства продуктов питания, препаратов (в частности, таксола, показанного для лечения рака молочной железы, или артемизина от малярии) или ароматических веществ, таких как ванилин. В будущем можно будет «гуманизировать» дрожжи путем замены всех метаболических путей для получения соединений, анализа и скрининга потенциальных лекарств и использовать их, а не на мышей или людей! Это было бы просто и быстро. У дрожжей есть ряд преимуществ по сравнению с бактериями; кроме того, это более безопасно, их компоненты легче выделить, и возможен выход на промышленные масштабы.

Вирусы грибков Mycoviruses довольно неактивны и никогда не покидают хозяина, у них нет белковой оболочки, и они с трудом реплицируются, полагаясь скорее на деление клетки-хозяина. Свободные вирусные частицы вне клеток встречаются редко или не существуют вообще. Внеклеточное существование для них нехарактерно, и они постоянно находятся внутри клеток. Грибки могут переносить вирусы без репликации. Одноклеточные пекарские дрожжи инфицируются Narnaviruses, содержащими, как следует из их названия, РНК. Это небольшие вирусы, по размеру в два раза меньше полиовирусов и пикорнавирусов, которые содержат 2900 нуклеотидов (нарнавирус состоит из одноцепочечной РНК со стабилизирующей шпилькообразной петлевой структурой, защищенной на каждом конце структурой типа «лист клевера»; у него нет оболочки, он кодирует только мультифункциональный белок, который отвечает за репликацию, упаковку и защиту РНК; это на удивление минималистичный мультифункциональный вариант вируса. Грибки производят несколько сот тысяч копий вирусной РНК, которые остаются внутри клетки).

У клеток грибков все это есть: последовательности генов от предыдущих инфекций, индуцированных ретровирусами, транспозонами, Ty-элементами (в аббревиатуре «y» обозначает грибок – yeast). Элементы Ty1–Ty5 – ретротранспозоны, при этом Ty3 очень похожи на ретровирусы (у них есть LTR-последовательности, gag, обратная транскриптаза, нуклеаза и интеграза, но нет оболочки), аналогично транспозонам у насекомых, в частности gypsy у мух и растений. Возможно, элемент Ty3, содержащийся в дрожжах, попал в клетки предшественников их нынешних хозяев, насекомых и растений, путем горизонтального переноса генов. Ту5 – модель для исследования архитектуры теломер, при этом у них на концах хромосом есть структуры, родственные обратной транскриптазе, и соответствующий механизм интеграции (см. главу 3). В соответствии с одной из трактовок транспозируемые элементы в дрожжах являются предшественниками ретровирусов – такое предположение было выдвинуто в 1980-х гг. одним из открывателей обратной транскриптазы Хоуардом Темином. А может быть, наоборот, дегенеративными ретровирусами?

Недавно «мобильные элементы» пекарских дрожжей, размножающихся почкованием, использовали для разработки лекарств от ВИЧ. Как сообщила Сюзанна Сэндмайерс из Ирвайна (Калифорния), было получено 60 новых соединений для препаратов. Взаимодействующие белки, 120 из них, влияют на мобильные элементы и, возможно, на ВИЧ. Это – факторы, находящиеся в клетках-хозяевах человека, которые взаимодействуют с ВИЧ как потенциальные мишени лекарственных препаратов. До чего же близкое родство между пекарскими дрожжами и клетками человека – достаточно близкое для скрининга препаратов против ВИЧ. Когда мы едим выпечку или пьем пиво, об этом, безусловно, нужно помнить!

Специалист по дрожжам Джоан Курчио (Элмхерст, Нью-Йорк) объяснила мне, почему вирусы так редко встречаются в дрожжевых клетках. Дрожжевые клетки (они бывают мужскими и женскими) чрезвычайно часто спариваются, что приводит к появлению нового потомства и формированию нового генетического материала. У многих других организмов задачу обновления генетического пула часто выполняют вирусы. Они являются двигателями эволюции. Но это не относится к дрожжам. Применительно к дрожжам можно сделать следующий вывод: у клеток дрожжей «секс» происходит чаще, и поэтому у них гораздо меньше вирусов. (Или, может быть, все наоборот: меньшее число вирусов создает условия для более активного секса?) У дрожжей нет известных заболеваний, передаваемых половым путем. Еще одна причина наслаждаться пивом.

Практически во всех лабораториях проводится «двугибридный анализ дрожжей» – интересный способ исследовать неизвестные белки в качестве партнеров по взаимодействию с белками-мишенями. Суть метода заключается в том, чтобы взять белок в качестве «приманки» (bait) и выбрать неизвестные связывающие белки в качестве «добычи» (prey). Если связывание достаточно сильное, активируется цветная реакция. Это надежный способ выявить новых партнеров по взаимодействию, если у исследователя не хватает воображения, чтобы найти новые темы исследования. Но как только исследователю удается «выловить» какой-нибудь новый белок, тут-то и начинается тяжелая работа – его нужно охарактеризовать. И вот тогда редакторы и рецензенты статей начинают задавать всевозможные вопросы и хотят получить ответы на все вопросы сразу. Объем данных увеличивается, и параллельно с этим растет число участвующих в исследовании ученых. В итоге у всех пропадает желание работать над проектом, после того как представившие результаты коллеги выстраиваются в очередь, чтобы их включили в список авторов публикации. И тогда возникает необходимость в руководителе, обладающем дипломатическими способностями.

Стволовые клетки – почти опухолевые?

Человечество мечтает о вечной молодости или о возможности ее вернуть, чтобы получить еще один шанс начать все с начала, попробовать прожить жизнь еще раз. На одном средневековом полотне изображено, как очень пожилые люди омолаживаются после омовения в волшебном котле. А в греческом мифе даже описана регенерация органов: Прометей был наказан Зевсом, который хотел вылепить людей из глины. В наказание за гордыню Прометея приковали к скале. Каждый день орел клевал его печень, которая за ночь восстанавливалась. Откуда древние греки несколько тысяч лет назад могли знать, что печень человека обладает способностью к регенерации? Посетителям экспозиции стволовых клеток в цюрихском музее задали вопрос: «Задумывались ли вы когда-нибудь, сколько вам лет?» Единственные клетки, которым столько же лет, сколько следует из вашего свидетельства о рождении, – это клетки хрусталика глаза и клетки некоторых сухожилий – они не снабжаются кровью. Все остальные клетки в организме моложе и постоянно обновляются; клетки кожи обновляются каждые несколько дней (отмершие клетки отшелушиваются за счет действия грамположительных и грамотрицательных бактерий); волосы растут со скоростью 1 см в неделю, а ногти – 4 см в год; лейкоциты живут один день, а эритроциты – 100 дней. Клетки других органов и даже головного мозга тоже обновляются. В связи с этим возникает вопрос: «Действительно ли я постоянно меняюсь? Кто я?» Применительно к загадке Дельфийского оракула, известной как «парадокс Тесея» или «корабль Тесея», возникает точно такой же вопрос: если все части корабля заменены новыми, остался ли корабль прежним? И сколько ему лет? Аналогичным образом деревянные японские храмы по своей структуре очень древние, но на протяжении веков дерево, из которого их строили, неоднократно обновлялось.

Рост волос и ногтей – разве это не пример самообновления? Для этого нужно задействовать стволовые клетки. Выдерните волос, и в его нижней части окажется скопление клеток. Часть из них – стволовые клетки, которые могут развиться во взрослые клетки. Стволовые клетки прячутся в луковице фолликула. В процессе миграции на поверхность кожи под воздействием факторов, вырабатываемых их окружением, происходит дифференциация этих клеток. И наоборот, человеческие эмбрионы являются источником эмбриональных стволовых клеток (ЭС) человека. У них сильно выраженная изменчивость, они являются тотипотентными и в зависимости от стимула способны развиться во взрослую клетку любого типа, что может привести к формированию новой личности! Однако их нужно выделить из эмбриона перед имплантацией – то, что остается послеоплодотворения in vitro. Выделение стволовых клеток вызывает неоднозначную реакцию, и в ряде стран эти процедуры либо запрещены, либо носят ограниченный характер. Ученым, которые хотят работать с такими клетками, приходится переезжать в страны, где такие эксперименты разрешены. В Германии ЭС-клетки, видимо, были выделены до 2007 г. Плюрипотентные стволовые клетки развиваются в несколько различных органов или типов клеток, например в печень. Затем существуют мультипотентные стволовые взрослые клетки, которые заменяют клетки в органах для их регенерации и могут вырасти только в определенные клетки. Стволовые клетки локализуются в эпителиальных тканях, как указывалось выше, костном мозге или пуповинной крови. Сердце и головной мозг не слишком активно регенерируются, в тканях этих органов практически нет стволовых клеток. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделяемые из костного мозга или крови, можно трансплантировать пациентам; они весьма эффективны при лечении определенных видов лейкемии. Стволовые клетки также обсуждаются в связи с развитием рака, но до сих пор остается открытым вопрос, задействованы ли они в этом процессе и какая роль им отводится в терапии рака. Их предпочтительнее называть не «опухолевые стволовые клетки», а «инициаторы опухоли» или «клетки-предшественники». Это удивительно, но некоторые родители десятки лет хранят клетки пуповинной крови новорожденных в качестве возможной «медицинской страховки» для лечения заболеваний, которые могут развиться у ребенка в течение жизни.

Прорыв в исследованиях стволовых клеток у людей произошел в связи с появлением «коктейля». Его ингредиенты дают возможность перепрограммировать дифференцированные зрелые клетки, чтобы они стали стволовыми. Мечта человечества осуществилась, поскольку этот коктейль способен превратить клетки взрослых мышей в эмбриональные. Этот коктейль может «перепрограммировать» клетки взрослого организма, чтобы можно было «все начать сначала». Все, что нужно для этого коктейля, – набор из четырех белков, которые называются с-Myc, Oct4, Sox2 и Kif4. Все они относятся к транскрипционным факторам, и каждый из них может регулировать большое количество генов – несколько сотен. Факт превращения зрелых клеток в эмбриональные подтверждается результатами имплантации в организм мыши-самки клеток, обработанных коктейлем, – развивается новая мышиная особь. Это действительно фантастический эксперимент: полностью специализированная (дифференцированная) клетка превращается обратно в эмбриональную, универсальную плюрипотентную клетку. Это вполне возможно, поскольку в каждой клетке, в том числе и в зрелой, присутствуют все гены, но лишь немногие из них активно экспрессируются в силу имеющихся у них клеточных программ. Существует 200 различных программ для 200 различных типов зрелых клеток. Программы омоложения должны быть в состоянии подавить все эти программы и реактивировать все гены, сделать все клетки плюрипотентными. Поскольку четыре фактора «индуцируют» это состояние, такие клетки называются «индуцированными плюрипотентным стволовыми клетками», или сокращенно iPS-клетками. Такие клетки могут запускать процесс заново и превратиться в одну из 200 различных типов клеток организма вследствии действия специфических факторов дифференциации. Простой способ – это поместить iPS-клетки рядом с тканью, которую нужно получить. Например, существующие клетки мышечных тканей способствуют формированию клеток мышечной ткани из iPS-клеток путем секреции факторов, стимулирующих специфические клетки мышечной ткани. Это основа регенеративной медицины.

IPS-система была разработана лауреатом Нобелевской премии японским ученым Синъей Яманакой из Киотского университета. Он систематически проводил исследования с целью выявления факторов, обеспечивающих это изменение, и протестировал 24 фактора в разных комбинациях. В результате было выделено четыре транскрипционных фактора. Ретровирусные векторы переносят гены для факторов в фибробласты кожи человека и активируют несколько сот генов. Транскрипционный фактор c-Myc стимулирует рост клеток, во время которого клетка проходит клеточный цикл и деление. Однако c-Myc также наблюдается во многих опухолевых клетках, при раке головного мозга или раке легких. Изначально его выявили как онкоген ретровирусов, о чем речь шла выше. Таким образом, при дерегуляции данного фактора или его чрезмерной продуктивности клетки могут превратиться в опухолевые. В этом заключается проблема со стволовыми клетками. Они находятся в опасной близости от раковых клеток. Рост опухолевых клеток остановить невозможно. А как остановить рост стволовых клеток? Сначала человек хочет, чтобы клетки росли, а потом стремится прекратить их рост. В настоящее время разрабатываются специальные методы, позволяющие при необходимости определенным образом включать или выключать эти четыре фактора. Кроме того, их необходимо контролировать и следить за тем, чтобы они экспрессировались в правильной дозе. Это снизит риск развития рака.

В 2012 г. Яманака получил Нобелевскую премию за «открытие зрелых клеток, которые можно перепрограммировать и получить плюрипотентные клетки», что означает получение iPS-клеток из дифференцированных клеток взрослого организма. Он разделил эту премию с Джоном Гёрдоном, ученым, представляющим старшее поколение. В 1962 г. Гёрдон трансплантировал клеточные ядра из кишечника лягушки в ее яйцеклетку и в результате получил настоящую лягушку. Как мне хорошо запомнилось, этот эксперимент вызвал скептицизм и даже некоторое неприятие. Позднее он лег в основу клонирования овец, кошек и собак. Все знают о клонированной овечке Долли, самой известной в мире овце, у которой не было отца. В 1996 г. в Шотландии ее клонировал Иэн Уилмут, выделив клетку из вымени шестилетней овцы. Он выделил клеточное ядро и имплантировал его в яйцеклетку без ядра. Так получилась овечка Долли. Однако ее генетическому материалу было уже шесть лет, поэтому теломеры на концах ее хромосом были укороченными, как у старых овец, и процесс омоложения был неполным. В скором времени у Долли развились возрастные заболевания, в частности артрит, и в 2003 г. она умерла. Смерть наступила в результате заражения вирусом овец – ретровирусом, состоящим в близком родстве с вирусом Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV), который около 40 млн лет назад способствовал образованию плаценты в организме человека. (Удивительно, что этот ретровирус до сих пор существует!) В конце концов, у Долли было потомство. Легко представить себе Иэна Уилмута в Стокгольме вместе с Яманакой и Джоном Гёрдоном. Рудольф Йениш из Института Уайтхед (Бостон), мой гамбургский друг, с которым я познакомилась много лет назад, помог нам разобраться в механизме перепрограммирования эмбриональных стволовых клеток; за эту работу он был удостоен многих наград.

Наличие iPS-клеток делает выделение ЭС-клеток неактуальным. Сегодня зрелые соматические клетки можно перепрограммировать, чтобы они превратились в iPS-клетки. Изучаются способы совершенствования этих методик.

Деление стволовых клеток происходит за счет специального механизма, то есть путем асимметричного деления, при котором одна часть клетки остается «прикрепленной к нише», а другая часть достаточно открыта, и на нее воздействуют факторы роста и дифференциации, в результате чего возникают новые клетки. Можно представить себе, что от арктического айсберга откалывается часть. Оставшиеся же клетки характеризуются способностью к саморегенерации и могут пройти неограниченное число делений. Получаемые стволовые клетки могут развиться в один из 200 видов специализированных клеток организма.

Лишь недавно стал известно, что зародышевые клетки переносятся навсегда, и, похоже, они вечны. В настоящее время это явление исследуется на модели червей С. elegans. У зародышевых клеток, должно быть, существует механизм омоложения, но они превращаются в смертные, если животные в силу мутаций становятся бесплодными. В настоящее время стоит задача выяснить, какие химические пути обусловливают омоложение и бессмертие.

Мечты о практическом применении результатов таких исследований стимулируют исследователей. Есть надежда, что можно «производить запасные части»: новые сердечные клапаны, новые диски для лечения заболеваний позвоночника, более здоровые тазобедренные суставы, более молодой мозг и новую кожу при ожогах – и все это можно получить из iPS-клеток. Сейчас уже разрабатывается методика получения искусственной кожи с помощью пигментов, но пострадавшим до сих пор приходится слишком долго ждать, пока у них вырастет новая кожа. Иммунная система не ополчится против «собственных» клеток, и отторжение не состоится, поскольку пациент и есть донор. Кроме того, донорские клетки волос или кожи ни у кого не вызывают опасения, и не нужно ждать, когда в результате аварии или естественной смерти доноров появится возможность трансплантировать нужные органы.

Однако до тех пор, пока эти методики не станут настолько совершенными, что будут применяться для лечения людей, можно представить более простые способы их использования. В лабораторных условиях из iPS-клеток пациента можно выращивать специализированные клетки, например клетки головного мозга, печени, сердечной мышцы или опухолевые клетки, с целью проверять их реакцию на лекарства. Можно определять эффективность препарата и его переносимость определенным пациентом. Для проведения лабораторных экспериментов понадобится несколько дней, зато это поможет снизить потенциальные риски и сократить расходы, так как стоимость разработки некоторых противоопухолевых препаратов составляет сотни тысяч долларов. Это один из аспектов персонифицированной медицины будущего. В США от последствий неправильного лечения ежегодно умирает около 50 000 человек. В Англии компании, занимающиеся страхованием здоровья, уже сейчас требуют проведения предварительного тестирования при страховании людей, которым назначается очень дорогое лечение.

Это стало бы еще одним шагом на пути к введению iPS-клеток непосредственно в сердечную мышцу пациента, где они могли бы трансформироваться в клетки сердечной мышцы под воздействием факторов дифференциации, поставщиками которых могут стать соседние клетки. На мышиной модели инъекция клеток непосредственно в сердечную мышцу, при которой им не нужно долго проходить через тканевые культуры, уже показала свою эффективность. Предметом процедур по омоложению являются рубцовые ткани. Возможно, со временем будет достаточно шприца с транскрипционными факторами, в частности c-Myc, которые вводятся непосредственно в рубцовую ткань при наличии локальных факторов дифференциации. Это было бы замечательно. Регенерационная медицина весьма многообещающа. Приоритетом внедрения этой терапии является кардиология, так как сердечно-сосудистые заболевания – одна из основных причин смертности в западных странах. Но на это потребуется время.

Совместно с американской компанией Neuronics мы проанализировали плюрипотентные стволовые клетки в чашке Петри и изучили роль факторов дифференциации в активации программ формирования специфических клеток. Мы распознали нейроны и увидели, как клетки бьются, словно сердце! Но вылечить опухоль не удалось. У основателя этой компании была опухоль мозга, и он всячески поддерживал разработку новой терапии данного заболевания. Он считал причиной возникновения своей опухоли чрезмерное использование первых мобильных телефонов, после того как они появились на рынке. Я всегда помню о том, что во время разговора аппарат нагревается, что стимулирует рост клеток и может способствовать развитию рака.

Помню первые флайеры, появившиеся в немецких поездах в 1960-х гг., рекламирующие «терапию клеточного омоложения». Ходили слухи, что наш канцлер Конрад Аденауэр, который тогда уже был довольно пожилым человеком, и папа римский лечились омолаживающим экстрактом из клеток, полученных из эмбрионов овец. Это соответствует скорее гормонозамещению, а не замене с помощью стволовых клеток. Если гормоны, например, быка и человека достаточно близкородственны, то, возможно, к некоторым из них это утверждение применимо. Данная терапия в настоящее время запрещена, поскольку может быть сопряжена с переносом заболеваний.

Согласно опубликованному в газетах сообщению, в Сан-Франциско отмечен случай эффективного лечения с использованием стволовых клеток человека. Однако, как потом выяснилось, это был обман! Такой же непорядочный поступок был совершен и в Японии. Почему же имели место сразу два подряд случая предоставления ложной информации о применении на практике стволовых клеток и соответствующих исследованиях, ведь совершенно очевидно, что обман сразу же раскроется, потому что все постараются воспроизвести эти результаты? Может быть, фальсификаторы научных данных – фанатики или нездоровые люди? Такие случаи были и раньше. Однажды в целях фальсификации мышь покрасили черными чернилами, а в другом случае на авторадиограмме фломастером нарисовали точки. Так можно бесславно закончить карьеру, и таким исследователям остается только работать на бензоколонке. Мне известен один такой случай. Однажды на научной конференции в США рядом со мной обедал молодой постдокторант. Он был героем этого симпозиума, а полученные им результаты украшали обложку сборника рефератов данного мероприятия. Мне он показался не вполне нормальным, скорее больным, чем гением. И действительно, он создал своему руководителю, известному биохимику, много проблем и ушел из науки. Однажды я провела почти все рождественские каникулы в лаборатории, где без посторонних глаз просматривала тетради и протоколы своей коллеги и анализировала данные, чтобы выяснить, не подтасованы ли они. К счастью, все было в порядке. Однако, как это ни странно, такое довольно часто случается даже в таких элитных научных учреждениях, как Швейцарская техническая школа Цюриха. Особенно сложно выявить подтасовку данных, осуществленную при помощи компьютера. Я бы не смогла обнаружить подлог за время рождественских каникул, поскольку не разбираюсь в современных программах, установленных на своем компьютере! Я решила, что мне не стоит больше оставаться ведущим автором статей в тех случаях, когда я не могу самостоятельно оценить биостатистические данные и не в состоянии гарантировать точность всех деталей. У меня возникает вопрос: единственный ли я исследователь, столкнувшийся с этой новой проблемой?

Новая голова гидры.

Что же такого интересного в гидре? Гидра упоминается в одном из древнегреческих мифов, согласно которому Геракл должен был убить Лернейскую гидру – один из десяти подвигов Геракла, – но как только он отрубал ей голову, на ее месте вырастали две.

Этот древнегреческий миф не безоснователен. Можно разрезать животное гидру – небольшой пресноводный полип – пополам, и вторая половина снова вырастает, заменяя потерянную. Даже если гидру пропустить через сито, из каждого из получившихся кусочков вырастет целое животное. Живая гидра – это самоорганизующаяся система. Кроме того, у гидры регенерируются некоторые нервные клетки, хотя они примитивнее наших. Как могут отрастать чувствительные волоски у гидры и как вырастают новая голова или нога? В настоящее время мы очень заинтересованы в замене или регенерации частей тела человека. В этом заключается суть вопроса, касающегося регенерации с помощью iPS-клеток тканей или органов. Нам нужны новые запасные части. Похоже, только печень преуспела в регенерации и хоуминге клеток. Хоуминг – явление, при котором клетка печени, введенная в вену руки, возвращается в печень.

В Обществе Макса Планка в Тюбинге Альфред Гирер отмечал свое восьмидесятилетие. Его любимый объект исследования – гидра, животное длиной всего несколько миллиметров, которое часто прикрепляется к стенкам аквариумов. Этому виду животных 500 млн лет. Появилось сообщение о том, что найден «активатор головы гидры», который, возможно, играет определенную роль в отрастании новой головы. В Тюбингене есть своя история изучения активаторов – здесь был открыт активатор Шпемана–Мангольд у лягушек. Гирер спрогнозировал градиенты фактора роста и, возможно, вдохновил Кристиану Нюсляйн-Фольхард, которая соседствовала с его офисом в Тюбинге, а позднее стала лауреатом Нобелевской премии, на исследование процесса формирования головы и хвоста у личинок мух. Ключевую роль в этом процессе играют градиенты факторов, морфогены. Положительные и отрицательные сигналы регулируют дифференциацию. Возможно, то же самое происходит у гидры, но разве этого достаточно? Вероятно, гидра никогда не «становится взрослой», находясь в эмбрионоподобном состоянии, и поэтому всегда может регенерировать недостающие запасные части (это мое предположение!). Поэтому взрослым людям, видимо, просто не повезло, и у них нет никаких шансов на регенерацию частей организма, которых они лишились.

Я могла бы стать аспиранткой, работая под началом Альфреда Гирера, но мне не хватило смелости и дальновидности, и в результате я стала работать на кафедре вирусологии, в соседнем с ним помещении. Позднее Гирер рецензировал мою диссертацию по ретровирусам. Ретровирусоподобные элементы играют определенную роль и у гидры тоже. В 2010 г. геном гидры в полном объеме секвенировали Джаррод Чепмен и его коллеги совместно с учеными из Института Крейга Вентера (Калифорния) – в работе участвовали 70 соавторов и 20 групп ученых. Полученные результаты стали основанием для включения информации о гидре в эту книгу. Но сначала следует сказать о назывании этой статьи – «Динамичный геном гидры». Геном гидры постоянно меняется, и налицо интенсивные «прыжки» генов. Геном гидры примерно на 57% состоит из ретроэлементов, действующих по принципу «копировать и вставить», необходимых для обратной транскриптазы, что способствует увеличению генома за счет дупликации. Ретроэлементы гидры не только проявляли активность много миллионов лет назад, но и сохраняют ее до сих пор. Кроме того, существуют более простые ДНК-транспозоны, которые функционируют в соответствии с принципом «копировать и вставить», они составляют примерно 20% генома гидры и активны до сих пор. Сейчас читатель все это знает! Новым для меня стало то, что можно определить три периода, когда у гидры чаще всего отмечаются «прыгающие» гены. Это вполне могло бы соответствовать определенным периодам в истории Земли. И что же тогда происходило – извержение вулканов, периоды обледенения и падение метеоритов? Тогда популяция гидры развивалась крайне медленно, многие особи погибли, а немногие оставшиеся передали потомству особенные свойства. «Прыгающие» гены восполнили геном. Их размер увеличился в три раза и в настоящее время составляет около 1 млрд пар оснований (это треть размера генома человека). Кроме того, было установлено, что гидра близко контактирует с ранее неизвестной бактерией. Исследователи не могут избавиться от нее в целях секвенирования. Это устойчивые симбиотические отношения, и в этом смысле они напоминают о ранее упомянутом черве с острова Эльба. Симбиотические бактерии помогают хозяину переваривать пищу. Можно ли узнать, как у гидры отрастала новая голова? У гидры нет четырех транскрипционных факторов, которые необходимы iPS-клеткам для роста, у них – только один такой фактор, а именно Myc (а точнее, c-Myc). Тем не менее существует четыре разных Myc-белка на радость специалистам по Myc. Способны ли несколько белков Myc способствовать отрастанию новых голов у гидры, не в этом ли кроется секрет? В то же время Myc является индикатором опухоли головного мозга у человека и обусловливает избыточное производство нейро-, или N-Myc до 10 000 раз. Myc стимулирует рост самых агрессивных опухолей головного мозга у человека. Таким образом, отрастание новой головы и ее смертельное заболевание разделяет очень тонкая грань, и оба эти процессы регулируются Myc. У гидры существуют и другие активированные сигнальные пути, известные по исследованиям рака, например путь Wnt, который играет роль в развитии рака молочной железы у мышей, что достаточно странно! Эти гены присутствуют везде – в геноме мышей, гидры и человека, то есть все мы родственники! (Wnt также является онкогеном, проявляющим активность как протоонкоген в стволовых клетках человека, а название Wnt – аббревиатура, образовавшаяся в результате слияния понятий «бескрылый» – wingless и «интегрированный» – integrated.)

Мы до сих пор не можем считать в ДНК информацию о том, как у гидры отрастает новая голова, но, возможно, транскриптомы, транскрипты всех активных генов, скоро поведают нам об этом. У гидры есть одно уникальное свойство: у нее нет возраста, она живет вечно. Большая ли часть клеток гидры стволовые или все? «Ген Мафусаила» – ген вечной жизни – недавно был обнаружен у гидры исследователями из Киля. Это вариант транскрипционного фактора Foxo3, который существует и у червей C. elegans, и, что гораздо важнее, у долгожителей. По имеющимся данным, на нашей планете есть одно животное, которому 10 000 лет. Таким образом, оно живет в 10 раз дольше, чем черепахи, которых многие люди считают самыми долгоживущими живыми существами на Земле – черепаха Дарвина умерла совсем недавно! Между тем на больших глубинах обитает один из видов губок; метаболизм у него носит не очень выраженный характер, существование очень ограниченно и монотонно, а состоят эти губки примерно из трех видов клеток. Эти клетки должны иметь нечто общее со стволовыми. Подобный ограниченный и ничем не примечательный образ жизни, похоже, является побочным эффектом долголетия. Насколько обобщенный характер носит такое утверждение и ждет ли человечество такое же будущее?

Так же, как и гидры, внимание исследователей привлекли планарии, поскольку они тоже способны восстанавливаться из отдельных кусочков. В этом смысле лучше известны ящерицы, у которых может отрастать хвост. До сих пор неизвестно, какие именно гены задействованы в этом процессе, и может ли этому способствовать Myc. Готова поспорить, что да! А зубы, восстанавливающиеся у крокодилов и акул, тоже могли бы стать предметом интересного исследования. Иногда у человека случайно происходит «третья смена зубов». Такие зубы вырастают из стволовых клеток на кончике корня зуба. Значит ли это, что стволовые клетки были на полпути к превращению в опухолевые, но их развитие очень вовремя приняло другой оборот и вместо опухоли образовался зуб?

Как-то по телевидению показали маленького ребенка, который лишился кончика пальца. Пострадавший палец обработали порошком, полученным из экстракта внеклеточного матрикса – вещества, создающего межклеточные контакты. Врачи были очень удивлены, когда кончик пальца снова отрос и даже ноготь регенерировался. Вероятно, это произошло так же, как при первоначальном росте за счет градиентов факторов роста или факторов дифференциации. Критически настроенный журналист задал вопрос: сыграл ли порошок важную роль в процессе регенерации кончика пальца? Но он не получил ответа. Однако регенерация пальца, возможно, объяснялась тем, что ребенок еще достаточно мал и у него оставались эмбриональные стволовые клетки. Возможно, коктейль из четырех транскрипционных факторов оказался бы более эффективным, чем порошок. А может быть, в порошке присутствовал только один фактор? В ходе исследований генной терапии дети также продемонстрировали более впечатляющие результаты, нежели взрослые, у которых терапевтические гены были отключены. Нам нужно определить программы дифференциации и реактивировать их как возможное начало регенерации отрезанных пальцев у взрослых. И нам для этого нужно больше, чем запасные пальцы. Вполне возможно, что мы узнаем еще что-то о долголетии.