7. Вирусы как ископаемые.

Унаследованные вирусы.

Хоуард Темин открыл не только фермент обратную транскриптазу, описанную в главе 3, но и эндогенные вирусы. Он был первооткрывателем в области исследований ретровирусов и обладал очень развитым воображением. Несмотря на ожесточенное сопротивление общественности и даже своих сотрудников, он утверждал, что должны существовать наследуемые формы РНК-содержащих ретровирусов, имеющих «промежуточную» ДНК-форму в ДНК-геномах хозяина. Для транскрипции вирусной РНК в ДНК эндогенным вирусам необходима обратная транскриптаза. Я была среди тех, кто не верил в это утверждение, и мне не удалось обнаружить обратную транскриптазу.

Обычно вирусы передаются «горизонтально», как экзогенные вирусы, которые могут распространяться внутри организма, а также от человека к человеку. Однако в ряде случаев такие вирусы могут инфицировать стволовые клетки, после чего они передаются «вертикально», от поколения к поколению. Как правило, это очень редкое явление, но такое может произойти, поскольку в организме вирусная инфекция распространяется триллионами вирусов. Обычно ретровирусы интегрируются в соматические клетки, но некоторые из них интегрируются и в стволовые клетки в качестве провирусной ДНК и передаются потомству. Можно ли унаследовать вирусы от родителей? Мы не должны этого делать – именно поэтому для целей генной терапии не разрешается использовать реплицирующие вирусы, которые могут интегрироваться в зародышевые клетки и передаваться будущим поколениям. В исследовательской деятельности это абсолютно запретная область.

Большинство унаследованных «эндогенных» вирусов происходят от ретровирусов. Но в нашем геноме могут оказаться и другие вирусы, даже РНК-содержащие вирусы, которые никогда не доходят до ДНК-стадии, используют одну из множества молекул обратной транскриптазы, плавающих в наших клетках, и производят копии ДНК, обеспечивая интеграцию. В настоящее время изучением этих вопросов занимается новая научная дисциплина – палеовирусология, которая появилась благодаря новым эффективным методам секвенирования. Исследователи всячески стремились найти вирусы в нашем геноме, и им это удалось.

Часто вирусы перестают продуцировать реальные вирусные частицы: они дефектны. Унаследованные последовательности эндогенных вирусов остаются в одних и тех же местах, и в силу этого их можно отличить от новых острых инфекций, которые встраиваются более или менее случайным образом. Это простой и легковыполнимый способ распознавания.

Мы рассмотрим механизм перехода от экзогенных к эндогенным вирусам на примере австралийских коал, так как в этом случае практически в реальном времени можно наблюдать процесс эндогенизации. Читатель может удивиться, узнав, что даже вирус Эбола способен проникать в линии зародышевых клеток. К сожалению, это не наблюдалось в организме человека, но имело место у летучих мышей, свиней и кенгуру. К сожалению? На этом вопросе нужно остановиться подробнее. Основная идея сводится к следующему: эндогенные вирусы защищают от экзогенных вирусов. Они их не пускают!

Экзогенные вирусы, главным образом ретровирусы, продолжают существовать в геноме (соматической) клетки на протяжении всей ее жизни. В случае ВИЧ жизненный цикл инфицированных лимфоцитов может составлять 60 дней. Затем клетки гибнут вместе с интегрированными в них ДНК провирусов. К этому времени продуцирующие вирус клетки распространяют 1010 вирионов в день. И все же такое выживание сохраняется практически навсегда, если ДНК провируса интегрируется в зародышевые клетки, поскольку эти клетки передаются из поколения в поколение. Таким образом, ретровирусы в организме отца или матери наследуются детьми как собственные гены, как «свой», а не инородный материал. Это продолжается 100 млн лет, а может быть, и дольше. В отличие от соматических клеток, зародышевые клетки, как правило, не продуцируют потомство, и потому новые вирусные частицы не появляются. 100 млн лет не является точно установленным временны́м рубежом, однако более продолжительные периоды интеграции трудно подтвердить, поскольку вирусные последовательности претерпевают мутации, изменения, делеции, которые в определенный момент аккумулируются настолько, что становится невозможно распознать вирусное происхождение ДНК.

Почему эндогенные вирусы накопились в наших геномах? Они должны происходить от реальных вирусных инфекций. Почему на протяжении миллионов лет они сохраняются в наших геномах как провирусная ДНК? По стечению обстоятельств? Случайно? Является ли интеграция надежным способом «укрывания» вирусов, которые прячутся под видом клеточных генов и так становятся недоступными для распознавания иммунной системой хозяина? Защищен ли эндогенный вирус от иммунной системы хозяина? Если это так, интеграция могла бы стать большим преимуществом не только для вируса, но также для клетки, в чем мы далее сможем убедиться. Все это действительно так.

У клетки практически нет шансов избавиться от эндогенной интегрированной ДНК провируса. В ней всегда есть некоторое количество остатков таких последовательностей. Есть концы провирусной ДНК, длинные концевые повторы (ДКП), которые являются промоторами для вирусных генов. Эти повторы идентичны на обоих концах провирусной ДНК в силу механизма репликации, задействованного в их образовании. Они могут рекомбинироваться после интеграции и тем самым устранять последовательности между ними, расщепляя «слоистые» структуры и оставляя за собой только один ДКП. Это приводит к формированию многочисленных одиночных ДКП и только нескольким полноразмерным ретровирусам. (В отличие от ДНК провирусов в клетках млекопитающих, ДНК профагов в бактериальных клетках может быть «выбита». Превосходят ли их фаги в этом отношении? Этот процесс индуцируется в бактериях под действием стресса, в силу чего бактерия-хозяин, как правило, лизируется, то есть погибает. У человека лизис клеток обычно не наблюдается.)

В случае гибели клетки гибнет и эндогенный вирус. Кроме того, если со временем эндогенные вирусы становятся бесполезными, клетки млекопитающих оказывают им противодействие и укорачивают их. Под понятием «бесполезные» подразумевается, что эти вирусы более не дают клетке никаких преимуществ и перестают защищать ее от внешних вирусов (см. далее). Как правило, оставшаяся часть вируса функциональна.

Именно так в наших геномах накапливается большое число поврежденных вирусов, и этот процесс идет миллионы лет. Зачастую первыми теряются гены, кодирующие белки оболочки Env. Эти белки необходимы для упаковки и высвобождения интактных вирусных частиц. Будучи лишенными Env-покрытия, вирусы становятся «голыми» и не могут ни покинуть клетку, ни проникнуть в новую. В этом случае существует две возможности: Env может быть утрачен, но также может быть приобретен во время эволюции или заимствован из вспомогательного вируса.

Кроме того, эндогенные вирусы можно инактивировать путем мутагенеза – этот механизм помогает избавиться от эндогенного вируса, по крайней мере функционально. «Стоп-кодоны» задействуются, когда вирусы перестают быть селективными, больше не способствуют защите клетки от других вирусов и начинают вырождаться. Эндогенные вирусы действительно дают клетке удивительные преимущества. Они способны защищать клетку-хозяина от суперинфекции, индуцируемой другими вирусами. Если клетка занята репликацией первого вируса, она блокирует проникновение в нее второго. Это явление называется «вирусная интерференция», что напоминает «интерферон», молекулу, обеспечивающую противовирусную защиту клеток млекопитающих, о чем мы поговорим в главе 9. Фаги тоже способны «занимать» клетки бактерии-хозяина, не допуская их инфицирования другими фагами. У бактерий это явление называется исключением гиперинфекции – предотвращением проникновения других фагов в клетки. Даже самые древние с точки зрения эволюции биоэлементы – вироиды, состоящие только из «голых» некодирующих нкРНК, уничтожают конкурентов, расщепляя (или разрезая) их. Этот механизм, называемый «сайленсинг», очень широко используется для иммунной защиты. Он основан на РНК, но вирусные белки тоже способны составить конкуренцию вирусам, захватывая рецепторы на поверхности клетки, которые зачастую являются якорями для внедрения вируса. Это один из многих, очень вариабельных, методов вирусной защиты. В общем, вирусы могут защищаться от других вирусов, обеспечивая клеткам противовирусную защиту, и обычно это называется иммунной системой клетки или организма. Все известные иммунные системы сформированы вирусами. И они созданы против вирусов! Вирусы похожи на противовирусную защиту!

Это сильное заявление, но его можно доказать. Существует взаимная выгода и для вируса, и для клетки. Таким образом, вирусы, даже поврежденные, могут оказаться полезными для своего хозяина. Поэтому, вероятно, они не исчезли, а остаются внутри наших геномов миллиарды лет.

Мировое научное сообщество испытало потрясение, когда выяснилось, что геном человека почти на 50% состоит из ретровирусов или вирусоподобных элементов. Зачастую они являются интактными вирусами и вырожденными ретровирусами. Это одни из самых впечатляющих результатов научных исследований XXI в., и они действительны для всех эукариотических организмов – млекопитающих, растений, насекомых, грибов и их спор и т.д. Другая неожиданность: даже интегрированные дефектные ретровирусные элементы способны «двигаться», но только внутри клетки, и у них нет шансов ее покинуть. И все же они передаются следующим поколениям в качестве клеточных генов и их трудно устранить.

Между тем при оплодотворении яйцеклетки действует весьма удивительная модель защиты. Новый эмбрион начинается «с нуля». Эмбрион наследует родительские гены со всеми эндогенными ретровирусами. Однако они, как правило, инактивируются путем сайленсинга, функциональной инактивации. Это фантастически эффективный механизм, изобретенный природой, который имеет целью инактивировать остатки вирусных последовательностей родительских генов и гарантировать новое начало жизни для нового поколения. Механизм сайленсинга был открыт лишь недавно. Сайленсинг вирусов основан на химических модификациях ДНК или хроматина, белок-содержащего упаковочного материала для ДНК. Дизайнерские гены, используемые в генной терапии, также подвергаются сайленсингу в поврежденных клетках как потенциально опасные – к большому разочарованию исследователей, врачей и пациентов.

Существуют ли эндогенные вирусы только в эукариотах? А в бактериях? Они присутствуют и в бактериях: до 20% генома бактерий состоит из ДНК профагов. И лишь недавно было установлено, что многие профаги фрагментированы и в них отмечаются вкрапления спейсерных последовательностей. Этот результат работы иммунной системы против фагов, обозначаемой CRISPR/Cas9, является самым впечатляющим прорывом в области молекулярно-биологических исследований. Таким образом, интегрированные ДНК профагов или ДНК провирусов защищают своих хозяев от фагов и вирусов соответственно. В одном случае хозяином являются бактерии/прокариоты, а в другом – эукариоты, включая нас.

Феникс из ДНК.

Геном человека кодирует примерно 40 000 эндогенных ретровирусов человека (HERV), интегрированных в качестве провирусной ДНК. Некоторые из них достаточно интактны и могут быть искусственно активированы в культуре клеток под влиянием соответствующих параметров среды, например УФ-излучения, «голода» и клеточного стресса, или при помощи сигнальных молекул, в частности интерферона. Одна группа таких эндогенных ретровирусов человека, HERV-K, до сих пор активна и может вырабатывать белки, а в редких случаях – даже интактные вирусные частицы, которые можно разглядеть в электронный микроскоп. Однако обычно они не могут переходить в другие клетки. Некоторые из этих вирусов были обнаружены в плаценте человека, в мозге мышиных эмбрионов, и возможно, что некоторые из них играют роль в развитии рака, например злокачественной меланомы, или при таких заболеваниях, как артрит. Пока еще рано говорить, важны ли эти наблюдения.

Часто HERV не полностью интактны и не могут реплицироваться. Как узнать, что эти эндогенные вирусы произошли от настоящих вирусов и что наш геном действительно представляет собой кладбище ископаемых вирусов? Это было настолько важно, что две группы исследователей пытались это доказать и нашли подтверждение. Тьерри Хайдман, работающий в Париже, проанализировал вирусные последовательности генома человека и сравнил их с девятью последовательностями ископаемых эндогенных ретровирусов. Все они были заполнены стоп-кодонами, и ни одна из них не могла экспрессировать белки, полные вирусные частицы или реплицироваться. Но стоп-кодоны распределялись неравномерно, поэтому Хайдман смог найти области c «открытыми рамками считывания» и соединил их. Он реконструировал полную длину ретровирусного генома, синтезировал последовательность как ДНК и перенес ее в клетки. Получился способный к репликации ретровирус, который при помощи электронной микроскопии можно идентифицировать как типичный ретровирус и который вновь обрел способность инфицировать другие клетки, включая клетки человека. Это неопровержимое свидетельство того, что «мертвые» эндогенные ретровирусы, населяющие наш геном в большом количестве, действительно произошли от реальных интактных вирусов, большинство из которых уже не существуют. Неожиданное воскрешение древнего вируса пугало. В данном случае критические замечания и даже массовые выступления протеста были бы вполне уместны, так как вирус, существовавший 35 млн лет назад и бывший активным еще 1 млн лет назад, может в настоящее время быть опасным и, возможно, даже провоцировать неизвестные заболевания. К моему удивлению, ни со стороны прессы, ни со стороны общественности никаких протестов не последовало. Или они недооценили потенциальный риск, или никто не понял суть эксперимента? Безусловно, авторы статьи предприняли все меры предосторожности. Вирус назвали Phoenix(«Феникс»), так как, чтобы снова стать реальным вирусом, он возродился, хоть и не из пепла, как птица феникс из греческой мифологии, а из нашего генома.

Независимо от этого Арис Катзуракис из Англии сравнил последовательности различных эндогенных ретровирусов млекопитающих и собрал из них согласованную последовательность, позволившую ему получить репликационно-компетентный инфекционный вирус, который он назвал HERVcon (con означает «консенсус»). Арису Катзуракису удалось инфицировать этим вирусом клетки и животных. Катзуракис также интересовался реконструкцией других древних вирусов из существующих геномов. Одним из них был кроличий ретровирус из эндогенного кроличьего вируса. Он дал этому вирусу достаточно образное название RELIK[16], что означает «кроличий эндогенный ретровирус типа K». Вирус RELIK эндогенизировался около 12 млн лет назад в геноме кроликов и представляет собой сложный лентивирус по типу, аналогичному ВИЧ. Это более сложные вирусы, и у них больше дополнительных генов, чем у часто выявляемых ретровирусов. До открытия RELIK существовало общепринятое мнение, что столь сложные лентивирусы не могут стать эндогенными. Вообще-то могут. Это свидетельствует о том, что некий ВИЧ-подобный вирус существовал очень давно. Он может быть еще древнее, чем определено в результате эксперимента. Непонятно, почему он выбрал для анализа именно геном кролика. Неужели спонсорами этого эксперимента стали люди, занимающиеся разведением кроликов?

Можно ли искать другие вирусы в геноме? Есть ли шанс найти неизвестные вирусы? Для того чтобы найти новые вирусы, необходимо иметь алгоритм их поиска. Это непростая задача. Как определить возраст древних вирусов и какой временной отсчет использовать? Для определения возраста вирусов можно сравнивать «концы» вирусов, вирусные промоторы, вышеупомянутые длинные концевые повторы (ДКП), которые «фланкируют» ДНК HERV провирусов. В результате синтеза провирусной ДНК они получаются идентичными. Со временем они могут аккумулировать мутации, равно как и любые другие гены. Зная скорость мутаций, можно создать разные модели мутаций, на основании которых сделать заключение, как давно разошлись пути развития двух ДКП. Некоторым вирусам HERV 100 млн лет. Мы проанализировали один из таких вирусов – HERV-K, и установили, что его возраст 35 млн лет.

Как коалы пережили смертоносный вирус?

Коалы – одно из самых любимых животных в Австралии. Много коал гибнет под колесами автомобилей, поэтому для них созданы специальные лечебницы. Поскольку на коал охотятся, повышается риск их вымирания. Для того чтобы спасти этих животных, многих из них перевезли на соседние с Австралией острова, где они находятся под защитой. Но на этих островах коалы заразились вирусом лейкоза гиббонов, обезьяньим ретровирусом, в результате чего многие особи погибли, но некоторые выжили. Более детальные исследования показали, что неожиданная устойчивость к вирусу у выживших коал объяснялась тем, что последовательности вируса обезьян были интегрированы в геном коал. Вирусные последовательности присутствовали во всех клетках коал на одних и тех же сайтах интеграции, свидетельствуя, что они эндогенизировались в этой локализации и стабильно передавались по наследству. В отличие от этого новые инфицирующие вирусы в геномах не имеют одного предпочтительного сайта интеграции и интегрируются в случайном порядке на большом количестве сайтов. Это простой, но очень информативный тест.

Процесс эндогенизации должен был бы занять несколько сот лет с момента переселения коал на острова с материка, где у них такие последовательности не выявлялись. Очевидно, вирусу удалось не только реплицироваться в соматических клетках коал, но и проникнуть в их зародышевые клетки, что привело к интеграции вируса на фиксированных сайтах их потомков. Таким образом, последовательности ретровирусов были переданы по наследству как эндогенные вирусы за невероятно короткое время, всего за 100 лет. Это была эндогенизация в реальном времени, от экзогенного вируса к эндогенному, и произошла она на удивление быстро. Исследователи изучали этот процесс как «реалити-шоу» эндогенизации. Эндогенные вирусы стали для организма «собственными» генами и утратили болезнетворность. Важный результат заключается в том, что эндогенные вирусы защищают коал от экзогенных. Это явление наблюдается и в ряде других случаев: вирус обезьян SIV (который привел к развитию ВИЧ у человека) не является смертельным для обезьян и даже не вызывает у них заболевание. Кроме того, вирус Эбола, став эндогенным, более не является смертельным для летучих мышей. Используется точка «больше не является», поскольку сначала вирус, видимо, уничтожал своего хозяина, но по прошествии довольно продолжительного времени они научились сосуществовать, в силу чего у выживших коал выработалась резистентность к этим вирусам. Как вирусы попадают в зародышевые клетки? Что представляют собой рецепторы? Сколько времени требуется для эндогенизации? Возникает несколько важных вопросов.

Эндогенизация в течение 100 лет соответствует примерно 20 поколениям коал. Можно было бы ожидать, что для этого необходимо несколько тысяч лет. Можно ли ожидать, что в течение такого же времени произойдет эндогенизация ВИЧ у человека? Защитило ли бы это человечество от ВИЧ? Десять поколений коал соответствовали бы 300 годам или более у человека. Это ужасно долго. Тем не менее наш геном полон последовательностей ретровирусов, накопившихся в процессе эволюции. Они намного-намного старше. Вирус RELIK у кроликов эндогенизировался 12 млн лет назад. Это сложный вирус, подобный ВИЧ. Что касается ВИЧ, до сих пор непонятно, способен ли этот вирус инфицировать зародышевые клетки. На наших зародышевых клетках может не быть рецептора для попадания вируса в клетку, и, если его действительно нет, может оказаться, что ВИЧ не в состоянии инфицировать их. ВИЧ может наследоваться только путем инфицирования. Способен ли ВИЧ меняться, чтобы внедриться в зародышевые клетки? Можно подождать и посмотреть, что произойдет. И все же защита организма человека от ВИЧ даже при быстром процессе эндогенизации протекала бы слишком медленно, и за нее пришлось бы заплатить многими жизнями.

Что касается эндогенного ВИЧ, существует прецедент: очень показателен пример «пенистых» вирусов. Они напоминают ВИЧ в том смысле, что имеют много дополнительных генов и демонстрируют сложную регуляцию генной экспрессии. Однако эти вирусы не патогенны для человека. Название «пенистые» дано вирусам по внешнему виду легких инфицированных животных или клеточных культур. Они могут инфицировать обезьян и человека, но не являются болезнетворными. Вирусы реплицируются только в организме обезьян, поэтому организм человека – «тупиковая ветвь эволюции» для данного вируса. Он безвреден для человека. «Пенистые» вирусы – самые старые из всех известных сложных (ВИЧ-подобных) ретровирусов, которым 100 млн лет. Сколько времени требуется вирусу, чтобы стать безвредным? Мы не знаем, но это точно происходит. Безусловно. SIV не убивает обезьян – больше не убивает, – но когда он перестал это делать?

Вероятно, подобные вирусы есть еще. Их трудно выявить, поскольку их геном состоит из ДНК, и таким образом, на первый взгляд они не напоминают ретровирусы. Кроме того, вирус овец (Jaagsiekte Sheep Virus, эквивалентный вирусу HERV-W, формирующий плаценту человека) существует в форме как экзогенного, так и эндогенного вируса.

Вирусы рыб также способны играть двойную роль – как экзогенно реплицирующиеся ретровирусы и как интегрирующиеся эндогенизированные вирусы. О вирусах рыб известно очень мало, однако количество рыбоводческих хозяйств в настоящее время растет, чтобы справиться со спросом на продовольствие. Возможно, у какого-нибудь вирусолога может возникнуть желание исследовать эти вирусы и поехать к немке Кристиане Нюсляйн-Фольхард, лауреату Нобелевской премии, которая в своих аквариумах, расположенных под крышей Общества Макса Планка в Тюбингене, держит 20 000 данио (рыбок-зебр) и разводит их. Эти рыбки очень часто используются для исследований, поскольку они прозрачны и можно наблюдать эффекты их мутаций. В США за научные достижения Кристиану приветствовали стоя. Королева мух стала королевой рыб. У них, безусловно, есть вирусы, просто мы пока о них мало знаем.

Палеовирусология.

Сколько различных типов эндогенных вирусов в настоящее время находится в нашем геноме? До сих пор речь шла о том, что ретровирусы могут интегрироваться двумя путями: горизонтальным и вертикальным переносом генов. Вирусные частицы распространяются от клетки к клетке или от одного животного к другому путем горизонтального переноса генов. Кроме того, существуют вертикально переносимые ретровирусы, которые инфицируют зародышевые клетки и интегрируются в зародышевые линии. Такие вирусы в этих клетках передаются следующему поколению. Когда был секвенирован геном человека, в нем выявили не только последовательности ретровирусов, но также (ДНК) последовательности ДНК-содержащих вирусов и ДНК из РНК-содержащих вирусов – вируса болезни Борна и вируса Эбола. Обычно эти два вируса никогда не адаптируют промежуточную ДНК. Она каким-то «секретным образом превращается» в ДНК-содержащие вирусы, используя необычный механизм. Возможно, обратная транскриптаза была позаимствована внутри клетки и способствовала обратной транскрипции РНК в ДНК, чтобы РНК-содержащие вирусы в качестве ДНК-копий могли интегрироваться в геном. Как мы недавно выяснили, наши клетки полны ОТ. Они могут происходить от других ретровирусов или ретротранспозонов и становятся «заимствованными». Так в геном животных интегрируются вирусы болезни Борна и вирус Эбола. Последовательность их геномов со временем не слишком изменилась, и можно предположить, что у них есть свое предназначение. Они действительно обеспечивают защиту от новых инфекций, провоцируемую тем же вирусом путем интерференции. Вирусы болезни Борна присутствуют в виде ДНК у многих видов животных – у человека, обезьян, мартышек, слонов, лемуров, мышей, крыс и птиц, но не у лошадей. Возможно, именно так у человека сформировалась невосприимчивость: последовательности эндогенных вирусов болезни Борна обеспечивают защиту от заражения экзогенным вирусом болезни Борна. У лошадей не обнаружены эндогенные вирусы болезни Борна, и их действительно поражают экзогенные вирусы болезни Борна и даже вызывают депрессию – да, у лошадей бывает депрессия. У человека эндогенные вирусы болезни Борна экспрессируют некоторые высококонсервативные ядерные белки вируса, защищающие нас от новых вирусных инфекций. У человека депрессия имеет иные причины.

Эболавирусы можно проследить в геноме животных примерно до 40 млн лет назад. Возраст некоторых вирусов может исчисляться даже 100 млн лет. Они на удивление интактны и даже в настоящее время экспрессируют некоторые вирусные белки, связанные с современным штаммом «Заир». Вирус Эбола и марбургский вирус относятся к филовирусам (такое название они получили потому, что на снимках, сделанных при помощи электронного микроскопа, похожи на тонкие нити) и попали в геном независимо друг от друга. Филовирусы присутствуют в геноме североамериканских летучих мышей, у азиатских приматов, у южноамериканских и австралийских грызунов, а кроме того, они найдены у свиней. В отличие от вирусов болезни Борна, вирус Эбола никогда не интегрировался в геном человека, поэтому у нас нет от него защиты. С чем это связано? Возможно, эта инфекция возникла совсем недавно, поскольку, как отмечалось выше, в примере с коалами, эндогенизация требует времени. Также вполне возможно, что зародышевые клетки человека не подвержены инфицированию вирусом Эбола. Это нужно еще проверить! Отличный исследовательский проект.

Существует еще около 10 вирусов, «незаконно» проникших в геномы млекопитающих. Среди них есть даже редкие вирусы, например цирковирусы, имеющие геномы с одноцепочечной ДНК. Они часто отмечаются у свиней, куриц и голубей. Исходя из этого, можно сделать вывод, что практически все типы вирусов, имеющие разные стратегии репликации, могут стать эндогенными вирусами в геноме млекопитающих. Интеграция – предпочтительный механизм для вирусов, реплицирующихся в ядре клетки. Таким образом, интеграция вирусов в геном человека идет постоянно, при этом процесс проходит в необычных условиях и направлен на защиту хозяина.

Кроме того, виды животных с эндогенными вирусами могут продуцировать вирусы, инфицирующие другие виды животных и, возможно, вызывающие заболевания. Пытался ли кто-нибудь выяснить, может ли свиной вирус Эбола инфицировать людей? Возможно, это следовало бы проверить.

Поврежденные вирусы.

Около 50% нашего генетического материала состоит из эндогенных ретровирусов или генов, родственных ретровирусам. В процессе эволюции организм человека подвергался многочисленным ретровирусным инфекциям, и все они оставили след в нашем геноме, подтверждением чему служат вирус «Феникс» (Phoenix) у человека и RELIK в геноме кролика. Со временем интегрированные вирусы мутировали и в ряде случаев более не распознаются как вирусы. Такие вырожденные вирусы не могут перемещаться, мигрировать или проникать в другие организмы. Они находятся внутри клетки или – даже более ограниченно – в ядре клетки. Старые вирусы «одомашнены» и предпочитают оставаться «дома»! Ученые называют их «ископаемыми» вирусами, а наш геном – «кладбищем» ранее имевших место вирусных инфекций. Этим «могилам» по крайней мере 35 млн лет, а некоторым, вероятно, и 200 млн лет. Другие же вирусы «молоды», им 1 млн лет. Несмотря на это, вирусные реликты на многое способны. Они могут перемещаться от одного сайта ДНК к другому, в силу чего их назвали «прыгающими» генами. Они могут попадать в наш геном и выходить из него, но не могут покинуть клетку. Эти «прыгающие» гены являются транспозируемыми элементами (ТЭ) или транспозонами.

Еще более «спортивными» являются некоторые вырожденные вирусы, которые делают «сальто», и при этом ДНК транскрибируется в РНК, а затем обратно в ДНК при помощи обратной транскриптазы. Затем эта копия ДНК интегрируется в геном. Данные транспозируемые элементы устроены так же, как ретротранспозоны.

Чтобы было понятнее, представьте себе компьютерную редакторскую программу по правке текста: нужно «вырезать и вставить» для транспозонов и «копировать и вставить» для ретротранспозонов. В первом случае часть ДНК вырезается, вставляется в другое место в геноме и интегрируется, что приводит к двойному повреждению ДНК. Во втором случае происходит интеграция транскрибированной ДНК, что является одноразовым генотоксическим событием. Генетический текст становится длиннее. Он увеличивается точно на размер части транскрибируемой ДНК. Ген дуплицируется – это механизм, имеющий чрезвычайно большое значение для нашего генома с точки зрения приобретения новых функций, которое заключается в том, что мутирует одна копия, а другая остается интактной и служит дублером. Очень давно геном человека «забыл» простой механизм «вырезать и копировать», хотя растения активно его используют и их геном до сих пор может пополняться таким же образом. Растения в этом смысле старомодны – вероятно, потому, что у них метаболические процессы протекают настолько медленнее, а адаптивные способности выражены настолько слабее, что два генетических дефекта обусловливают больше инноваций, чем один. Наш геном отказался от механизма «вырезать и вставить» примерно 35 млн лет назад, когда переключился на механизм «копировать и вставить». Нужно точно представлять себе различия между ДНК-транспозонами и ретротранспозонами, которые часто относятся к подкатегории «транспозируемые элементы» (ТЭ). При интеграции ретротранспозоны вызывают только одно повреждение, и это менее серьезное изменение или вариации апробированных и эффективных свойств.

В целом принцип прост – транспозоны ведут себя как вирусы с одним лишь ограничением: они могут перемещаться внутри клетки, а не между клетками, то есть они эндогенные, а не экзогенные. Заточение «прыгающих» генов можно трактовать и иначе – вероятно, это произошло на самых ранних этапах эволюции, и в этом случае эндогенные вирусы могли предшествовать экзогенным. Вполне возможно, что первые вирусы могли перемещаться исключительно внутри геномов и лишь позднее научились мигрировать из клетки в клетку или из одного организма в другой. Аргументом в пользу этой гипотезы служит то, что «покрывающий» белок – оболочечный Env-белок ретровирусов, который необходим для упаковки вирусов и их перемещения на более длинные расстояния, – появился позже других вирусов. Вирус может покинуть одну клетку и проникнуть в другую только в том случае, если он защищен оболочкой. Однако оболочечный белок может быть тоже потерян. Вероятно, были задействованы оба механизма – приобретения и дегенерации – и находившиеся в заточении вирусы обрели способность мигрировать, а вирусы, обладавшие способностью к миграции, оказались в заточении. Здесь также нельзя исключить возможность существования общего предка.

В одном из самых примечательных научных трудов, которые я когда-либо читала, приводилось описание открытия всех этих «экс-вирусов». Эта работа была опубликована в начале третьего тысячелетия и послужила началом совершенно нового научного направления, в рамках которого было поставлено такое количество вопросов, что их хватит не на один десяток лет. Около ста лет назад, когда Макс Планк был еще студентом, ему не советовали заниматься физикой, так как считалось, что физика себя изжила и перестала существовать как наука. Именно в это время открытия квантовой механики положили начало новой физике, которая полвека оставалась на переднем крае научных исследований. Поиск ответа на вопрос, каково значение последовательностей в нашем геноме, может занять еще полвека. Если этого времени окажется достаточно!

Столь значимый научный труд, о котором я говорю, был опубликован в Nature в 2001 г. Публикация представляла собой обзорную статью о работе Международного консорциума по секвенированию генома человека, первым автором которой был Эрик Ландер, и в ней использовались материалы почти 20 лабораторий всего мира. Эта работа объемом 60 страниц более чем с 40 рисунками озаглавлена «Первоначальное секвенирование и анализ генома человека» и является самой большой публикацией, которую мне приходилось видеть в данном журнале. Невозможно было себе представить, что наш геном состоит из вирусов! Из более или менее сложных вирусов, экс-вирусов и вирусоподобных элементов! На 50% или больше? На 80%? На 100%? Именно это побудило меня написать эту книгу – я хотела поделиться с читателями информацией и попытаться пояснить ее.

Авторы научных работ делят прогресс в биологии в XX в. на четыре четверти по 25 лет каждая. В первой четверти были повторно открыты хромосомы и механизмы наследования в контексте законов Грегора Менделя. Во второй произошло открытие двухцепочечной ДНК как основы наследования и хранения информации. В третьей четверти появились рекомбинантные ДНК-технологии и клонирование генов, а в четвертой – расшифровка генов и генома. К 2001 г. секвенировали последовательности геномов 599 вирусов и вирусоидов, 205 существующих в природных условиях плазмид (двухцепочечные кольцевые «голые» ДНК), 185 органелл, 31 бактерии, семь архей, одного гриба, двух животных и одного растения, а также геномов двух людей – Дж. Уотсона и К. Вентера. Потом появилась вышеупомянутая работа, и начиная с 2001 г. события в этой научной сфере происходили с невероятной скоростью. Буквально за 15 месяцев было секвенировано около 95% генома человека, в котором последовательностей в 10 раз больше, чем всех предыдущих последовательностей, вместе взятых. Геном человека состоит из 3,2 млрд нуклеотидов. Какую информацию они в себе несут? Эта информация нам по большей части неизвестна, так как мы знаем четыре буквы (обозначения отдельных нуклеотидов), но не понимаем, что они означают, по крайней мере большинство из них. Первым шоком стала информация, что у нас лишь 20 000 кодирующих генов, то есть генов, кодирующих белок (по расчетам исследователей, их число составляло 30 000, но позже цифра была скорректирована в сторону уменьшения и сейчас составляет 22 000–20 000 генов). Если исходить из общего числа нуклеотидов, можно было ожидать в 10 раз больше. Бытовало мнение, что человек – существо особое – так думают люди! А сейчас выясняется, что у человека генов не больше, чем у многих других организмов. А что же делает человека человеком? Открою один секрет: наши гены длиннее (именно в этом кроется ошибка в расчетах) и они фрагментированы на участки, описанные нами выше как экзоны и интроны, где экзоны (их примерно семь на ген) могут рекомбинироваться за счет сплайсинга.

Способность комбинировать кусочки генома – вот что делает нас «великими» (и отличает от других). Комбинаторика. Следующий большой сюрприз заключался в том, что наши гены не уникальны, а представляют собой «винегрет» из генов, химер, сформированных из всех видов источников: бактерий, архей, грибов, растений и какого-то «бессмысленного мусора» – в последнее многим из нас не хотелось бы верить. Мы в самом деле не знаем, действительно ли в нашем геноме есть «мусор». Большая часть генетической информации в нашем геноме не является «человеческой» и появилась в результате горизонтального переноса генов (ГПГ) от многих других живых организмов, обитающих вокруг нас. Примерно 10–20% нашего генома идентично геному бактерий; почти на 50% наш геном схож с геномом ретровирусов или ретровирусоподобных элементов; 5% генов мы получили от грибов; пока невозможно определить вклад архей, растительных или иных вирусов. Другие гены не коррелируются с известными вирусами – они нам просто неизвестны, многие некодирующие гены в настоящее время являются предметом активных исследований. Мы все родственники – все живые существа являются «братьями и сестрами». Я всегда об этом вспоминаю, когда случается наступить на дождевого червя, после чего он погибает. Еще одним напоминанием об этом служит посвященный мне Томасом Лархером этюд «Не наступай на дождевого червя» из его цикла «Поэмы».

Столь впечатляющие результаты исследования состава генома человека и его взаимосвязи с геномами всех живых существ на планете даже подвигли тогдашнего папу римского Бенедикта XVI обратиться к ученым за разъяснениями. Еще некоторое время назад напечатанная в Nature статья попала бы в список запрещенных Ватиканом публикаций. Мы не настолько уникальны, как думали. И все же нельзя сказать, что человек свержен с пьедестала. В конце концов, мы самые сложноорганизованные живые существа.

Наш геном почти на 50% состоит из древних ископаемых вирусов. Чем старше вирус, тем более он вырожден и тем короче. Исходя из длины вирусов, можно разработать простую классификацию: от длинных к коротким, включая, например, HERV, длинный диспергированный повторяющийся элемент (LINE), ДНК-транспозоны, короткий диспергированный повторяющийся элемент (SINE) и короткие последовательности Alu. ДНК-транспозоны не вполне вписываются в данную классификацию, поскольку они необязательно бывают короче. Следует упомянуть еще одно правило: чем короче транспозируемые элементы, тем их больше – вероятно, потому, что для них не требуется много пространства.

Эти вирусные элементы входят не только в наш геном, но и в геномы всех видов животных и растений, всех без исключения – кур, мышей, утконосов, опоссумов, грибов, растений, мух – и далее по нисходящей вплоть до червей, обитающих у побережья острова Эльба (см. главу 10), и медуз. Однако есть определенные различия. В геноме человека больше LINE; в геноме кур нет SINE, в то время как у утконосов их больше; в геноме риса и грибов нет ретротранспозонов. Пока никто не выяснил, чем это объясняется. Я спросила об этом у Михаэля Кубе, одного из исследователей, проводивших анализ генома утконоса (в то время Кубе работал в Обществе Макса Планка в Берлине). Он не смог это объяснить, и пока никто не может. Как сформировался геном у нас и как – у остальных организмов? Мы получили такой геном в какой-то момент своей истории как результат переноса генов (ГПГ) и вследствие разнообразных вирусных и других микробных инфекций. Для нашего генома вирусные инфекции крайне полезны, так как дают толчок инновациям. Многие новые гены попадают с первой попытки. Это выгодно для генома. Вирусы – самые разносторонние «изобретатели». Они являются двигателями эволюции. Читателю нужно представлять себе, в каком направлении она развивалась: нас создали вирусы и микроорганизмы! Вот новый взгляд на наш мир.

Что нам дают вирусы: рак или гениальность?

Есть ряд деталей, которые читатель мог упустить из вида, поскольку сводное заключение было приведено чуть выше. Но, вероятно, последующие разделы также окажутся информативными.

Эндогенные ретровирусы человека (HERV) – самые крупные ретроэлементы в нашем геноме. Они составляют до 8% нашего генома, их 450 000. Из них полностью интактными являются лишь около 40 000. В качестве промоторов у них два ДКП, по одному с каждого конца, а для репликации используются гены gag и pol. Белки pol состоят из вирусной протеазы, обратной транскриптазы, РНКазы Н и интегразы, всех ферментов, необходимых для репликации полного ретровируса. Белок оболочки Env не всегда присутствует. Большинство эндогенных вирусов интактны и полны мутаций. Некоторые из них могут выходить из клетки как частицы, но не могут инфицировать другие клетки. Эндогенные вирусы, которые до сих пор выявляются, предпочитают интегрироваться между «реальными» генами в интроны, что менее вредно для нашего генома, нежели интеграция в одном из 20 000 реальных, кодирующих белок генов. Видимо, до сегодняшнего времени сохранились клетки только с такой безопасной интеграцией, других уже не существует. Согласно нашим расчетам, интеграция определенного HERV-K, который мы анализировали, произошла 35 млн лет назад. Может возникнуть вопрос, что происходило на планете в это время. Метеориты, солнечный ветер, образование сверхновых звезд, изменение положения оси вращения Земли – все что угодно, и никто ничего точно не знает.

Моему коллеге Феликсу Брекеру удалось показать, что интегрированный эндогенный ретровирус HERV-K способен вызывать рак. Интегрированные ретровирусы могут вставляться в «правильном» или «неправильном» направлении, что означает параллельную или непараллельную ориентацию генов. Продукты «считывания» вируса, попавшие в соседние гены, могут либо усилить, либо ослабить их экспрессию. Если соседний ген абсолютно необходим (например, ген – супрессор опухоли), а непараллельная экспрессия вируса инактивирует его, то клетка может стать раковой. Мы смогли продемонстрировать это явление в лабораторных условиях на культуре клеток. Является ли это одной из причин развития рака? Где, при каких опухолях и как часто это может происходить? Такого рода трудные вопросы мне задавали рецензенты нашей рукописи. А мы не знали ответов на них. Даже специалисты в области информатики из Принстонского института перспективных исследований не располагали базой данных, полученных при анализе опухолей пациентов, в которой было бы достаточно сведений для ответа на этот вопрос. Думаю, что на этот вопрос в принципе не удастся ответить. Даже ученые из одного крупного консорциума по изучению рака, основываясь на имеющейся у них базе данных, не смогли понять, постоянно или эпизодически HERV участвует в развитии рака. У некоторых пациентов HERV-K участвует в развитии амиотрофического бокового склероза (АБС), тем не менее до сих пор остается открытым вопрос, насколько повсеместный характер носит это явление.

Существует много вырожденных HERV, которые могут сократиться до одного-единственного промотора ДКП. Так бывает, если вирусы устраняются путем рекомбинации двух идентичных ДКП: все остальные образуют «лассо» или «петлю», которые затем разрезаются. Один ДКП – это самое мелкое, что остается от ретровируса, это его след. Тем не менее все эти остаточные промотор-подобные «соло-ДКП» все еще могут влиять на соседние гены, включая их или выключая, что очень много!

Следующие достаточно близкие родственники – это ретротранспозоны или ретроэлементы. Их основная характеристика заключается в транспозиции ДНК при содействии РНК через механизм обратной транскриптазы, для чего используется механизм «копировать и вставить». Ретроэлементы очень похожи на ретровирусы тем, что они кодируют обратную транскриптазу, молекулярные «ножницы» РНКазу Н, интегразу и РНК-связывающий белок для транспорта и защиты РНК. У них также имеются длинные концевые повторы (ДКП), которые являются вирусными промоторами, необходимыми для интеграции и регуляции генной экспрессии. При наличии белков Env они могут покинуть клетку, а без Env – нет. Их часто называют эндогенными ретротранспозонами.

У ретротранспозонов есть и вторая разновидность, еще короче и лишенная промоторов ДКП, которая называется длинными диспергированными повторяющимися элементами (LINE), у них только два набора белков – Orf1 и Orf2, которые используются для транспортировки, и обратная транскриптаза вместе с эндонуклеазой – для транспозиции. LINE-элементы, или сокращенно L1, являются транспозируемыми элементами (ТЭ) и могут «прыгать» с помощью механизма «копировать и вставить», в результате чего геном увеличивается путем дупликации генов. Они составляют 21% нашего генома, а длина каждого – 10 000 нуклеотидов. В геноме человека содержится примерно 850 000 копий этих LINE-элементов. LINE-элементы дуплицировались, «размножались» более 80 млн лет, влияя на геном человека. Некоторые из них до сих пор активны, и примерно 100 из них в мозге эмбрионов, или, в соответствии с другими оценками, по одному на 10 000 клеток. Было показано, что некоторые из них способны «прыгать» в тканях головного мозга эмбрионов мышей и вызывать серьезные изменения. Как показал Фред Гейдж, американский исследователь головного мозга, при одном из психоневрологических заболеваний, синдроме Ретта, «прыгающие» гены отмечаются в мозге здорового человека чаще. Было зарегистрировано около 60 случаев этого заболевания, что может быть связано с новыми вставками, способными индуцировать развитие таких заболеваний, как гемофилия, болезни мозга, аутизм и рак. Совсем недавно Фред Гейдж высказал гипотезу о том, что даже старческое заболевание – болезнь Альцгеймера – связано с действием транспозируемых элементов. За жизнь нейрона взрослого человека в среднем происходит примерно 14 таких «прыжков», и их последствия никому не известны.

Предполагается, что активация ретроэлементов происходит на фоне клеточного стресса. Такой стресс может быть индуцирован УФ-излучением, действием химических веществ, ядов или агентов, повреждающих ДНК. Существуют веские основания для активации ТЭ. Если клетка находится в состоянии стресса, возможно изменение ее свойств, способных помочь ей справиться со стрессом, а ретротранспозоны могут обусловить быстрое появление новых качеств и повышение выживаемости. Повторю свою «мантру»: вирусы являются двигателем эволюции и создателями новых свойств. Без них мы бы не выжили!

И в заключение отмечу следующее: если показатель заболеваемости LINE-заболеваниями не является верхушкой айсберга, значит, они крайне редко провоцируют болезни. У меня сложилось такое впечатление, но возможно, в будущем появится больше данных, опровергающих мое представление.

Механизм «копировать и вставить» приводит лишь к точечному повреждению генома. Чтобы этого не произошло, в соматических клетках процесс «прыжка» контролируется жестче, чем в эмбрионах. Там «прыжки» могут иметь серьезные последствия. Могут ли они, помимо заболеваний, обусловить рождение нового Моцарта, Ньютона или Эйнштейна – то есть рак или гениальность? В настоящее время рассматривается возможность развития аутизма и таких состояний, как синдром Аспергера («мудрецы» с исключительными качествами), в результате действия этого механизма и вопрос, могут ли «прыгающие» гены привести к рождению Ньютонов и Эйнштейнов.

Возможно, ретротранспозоны вносят свой вклад в способность человека разговаривать, формировать модель социального поведения, а также влияют на его сознание. Похоже, что даже растения научились таким образом привлекать насекомых для репликации и обмена генами. «Лотос» (Lotus) – таково привлекательное название ретротранспозона у цветущих растений. У культивируемых растений имеется огромное количество транспозируемых элементов (ТЭ). В геноме кукурузы на их долю приходится 90%, а в геноме пшеницы – более 80%. Для сравнения: доля ТЭ в геноме человека составляет примерно 42%, а по некоторым оценкам – 66%. Выявить ТЭ при проведении анализа генома не так-то просто, поскольку они не всегда находятся на одних и тех же местах, а их местонахождение не совпадает с местонахождением ТЭ в референсном геноме. Такие сравнения обычно основаны на сопоставлении «сохраняющихся» свойств, поэтому при проведении анализа секвенирования «прыгающие» гены и интегрированные вирусы легко не заметить и даже счесть чем-то незначащим. Их релевантность недооценивается, несмотря на их вклад в осуществление эффективных инноваций в геномах многих видов живых существ.

Ретротранспозоны обусловливают дуплицирование генов. Такое явление часто происходит в геноме человека и коррелируется со свойствами, которые делают нас особенными. Специалист по эволюции Сванте Пааб, работающий в Лейпциге, проанализировал дупликацию генов в геномах человека и обнаружил эндогенные ретровирусы, а также LINE-элементы в геноме неандертальца. Неандертальцы жили примерно 200 000–40 000 лет назад.

Дупликация генов характеризуется наличием «опорной ноги» и «свободной ноги» – как у греческих статуй, – таким образом, одна «нога» может без всякого риска пробовать внедрять инновации, поскольку вторая «нога» копирует информацию. Поэтому дупликация генов может оказаться особенно важной для расширения генома и новых адаптаций. Дуплицированные гены способны к вырождению и остаются в качестве псевдогенов, не выполняющих никаких действительных функций. Около 100 млн лет назад геном дрожжей удвоился. Рекорд принадлежит пшенице, геном которой увеличился в шесть раз, и сейчас он огромный, больше нашего. Геном тюльпана в 10 раз крупнее нашего генома, с тремя связанными между собой хромосомами, что, возможно, является следствием разведения этих растений.

В геномах человека самый высокий показатель амплификации генов отмечается в опухолевых клетках, где большое количество онкогенов увеличивается не менее чем в 20 раз. В частности, ген Myc амплифицируется в опухолевых тканях мозга в 10 000 раз, и, видимо, именно этим обусловлена высокая агрессивность именно этого вида опухоли.

Кто создал ДНК-вирусы?

Я бы хотела представить в лучшем свете присутствующие в нашем геноме мелкие вирусные остатки; впрочем, их очень много, и они могут кое-что делать. Относятся ли они к широко обсуждаемой «мусорной» ДНК – отбросам, забытым остаткам? На этот вопрос пока нет однозначного ответа. Возможно, у некоторых читателей возникнет желание перейти к следующей главе.

Следующая малочисленная группа транспозируемых элементов состоит из еще более коротких SINE, коротких диспергированных повторяющихся элементов, которые гораздо меньше и ни на что не способны. Они «бродят» по нашему геному, влияя на другие гены. Это их характерное поведение. Они захватывают обратную транскриптазу (ОТ) более крупных LINE, поскольку у них нет собственной. Таким образом, они существуют за счет чужих обратных транскриптаз. SINE образуются на основе РНКаз, которые подверглись обратному транскрибированию в ДНК и интегрировались как SINE-ДНК. У SINE также отсутствуют вирусные ДКП-промоторы, и, следовательно, они не оказывают пагубного долгосрочного воздействия. У них нет эндонуклеаз, но они используют простые ДНК-разрывы, чтобы проникнуть в ДНК геномов. В нашем геноме на долю SINE приходится примерно 13%, хотя каждый SINE имеет всего лишь 100–300 нуклеотидов. Их очень много, в общей сложности 1,5 млн копий. Исторически сложилось, что SINE стали считать «мусором», но они могут обусловить формирование новых функций.

Самыми мелкими ТЭ являются последовательности Alu, которые имеют 300 пар оснований с повторяющимися ДНК-последовательностями. Я бы предпочла не затрагивать в этой главе Alu-последовательности, поскольку это существенно осложнит для читателя понимание причинно-следственных связей. Alu отмечаются только в геномах приматов, в нашем геноме их примерно 1 млн, и эти 10% состава нашего генома нельзя не принимать в расчет. Они не кодируют белки и, скорее, содержат более короткий внутренний промотор, а не ДКП, который влияет на соседние гены. Alu получили такое название от фермента Alu, полученного из бактерии Arthrobacter luteus(аббревиатура не имеет никакого отношения к алюминию, хотя это действительно помогает запомнить название). Фрагменты ДНК являются носителями последовательности, распознаваемой ферментом Alu, который ее расщепляет, позволяя, таким образом, идентифицировать элементы. Элементы Alu могут «прыгать», только если они заимствуют обратную транскриптазу, как это делают SINE-элементы. РНКазы этих элементов стимулируют регуляторную функцию РНК в геноме человека. Регуляция в данном случае носит локальный, а не долгосрочный характер. В геноме человека самое большое количество SINE/Alu. Однако ни у одного из живущих на Земле животных нет такого количества Alu, как у австралийских утконосов, и никто не знает – почему!

Никто не понимает, почему около 50% нашего генома состоит из ретровирусоподобных элементов. Мог бы он на 100% состоять из таких элементов – или только на 50%? Возможно, мы замечаем лишь последовательности вирусоподобных элементов из этих 50%, а оставшаяся часть генома более не распознается как вирусы или пропала в генетическом шуме.

Кроме того, 50% – это не предельное, а среднестатистическое значение. Некоторые гены человека на 80–85% состоят из ретроэлементов, что доказал Феликс Брекер, проанализировав такой ген (бета-ингибитор протеинкиназы, который ингибирует киназу РКВ/АКТ). Ретроэлементы скомпонованы не линейно, а накладываются друг на друга и могут интегрироваться друг в друга. Шаг от 90 к 100% достаточно серьезный, но не является фундаментальным препятствием. И вот у меня возникает вопрос: состоял ли в свое время наш геном на 100% из вирусов? Существует ли верхняя граница количества «прыгающих» генов? Если исходить из того, что имеется 1,5 млн транспозируемых элементов и каждый состоит из 10 000 нуклеотидов – что соответствует современным представлениям о размере ретровирусов, – его общая длина должна превышать размер нашего генома в пять раз. Вероятно, не все «вирусы» существовали в одно и то же время и имели полную длину.

Состоял ли в свое время наш геном только из ретровирусных элементов? Подозреваю, что да, но не могу доказать и уверена, что некоторые коллеги поставят под сомнение это утверждение. И все же мой коллега, которому я изложила идею, не откладывая в долгий ящик, обратился к этому вопросу в своей следующей лекции: Луис Вильярреаль, первооткрыватель и один из первых исследователей, отметивший роль вирусов на первых этапах формирования жизни на Земле и в начале эволюции. Вирусы могут содержать достаточно информации для формирования наших геномов. В вирусных последовательностях больше информации, чем в последовательностях всех живых существ, вместе взятых. Я вполне могу себе представить, что ретроэлементы являются предшественниками ретровирусов или укороченных ретровирусов и формируют наш геном. Мне сложно опровергнуть утверждения коллег, считающих, что вирусы являются спутниками, покинувшими клетки. А откуда взялись клетки? О том, что предшествовало ретровирусам, мы поговорим в разделе, посвященном РНК-вироидам, или рибосомам (см. главы 8 и 12).

Невозможно отследить историю существования вирусов больше, чем на 100 млн лет назад. Гоминиды жили примерно 200 000 лет назад. Люси гораздо старше. Вероятно, она самая древняя женщина-австралопитек, жившая в Эфиопии около 3 млн лет назад. Она была невелика ростом – 1 м 10 см, руки свисали ниже колен, но она ходила прямо на двух ногах. Это значит, что они наши родственники – и все же жизнь началась 3,9 млрд лет назад. А что произошло между этими двумя датами? Это огромный временной разрыв. Нет оснований полагать, что в это время ретровирусы или их родственники не могли заполнить геномы бактерий, архей, растений, животных и человека. И даже у гидры, утконоса, дрожжей и небольшого дикорастущего цветка резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana) во всем обнаруживается схожий генетический состав. Словосочетание «во всем» означает – у всех эукариотов. При наличии слишком большого количества изменений поисковые компьютерные программы начинают давать сбой и становится невозможным внести исправления. «Феникс» – один из ретровирусов, реконструированных из нашего генома, ему 35 млн лет.

Я пыталась объяснить Фримену Дайсону, почему считаю, что нас создали вирусы, что вирусы не вызывают у нас заболевания, а помогают приспосабливаться, что, возможно, вирусы – наши древнейшие предки, а он слушал меня и посмеивался, сидя в своем заставленном от пола до потолка книгами офисе в Принстонском институте перспективных исследований. Мои слова его сразу же заинтересовали, и чем более неожиданными и противоречивыми оказывались аргументы, тем больше ему нравилось их обсуждать. «Непременно изложите это на бумаге», – сказал он по-немецки. Он хорошо говорит по-немецки, но скрывает это. Он умеет меня воодушевить, даже несмотря на то, что зачастую его мнение отличается от моего. В конце концов, он автор книги «Ученый-бунтарь».

Следующая группа транспозируемых элементов – ДНК-транспозоны. Считается, что они никак не связаны с ретровирусами, ну или по крайней мере так пишут в учебниках. Это действительно так? Возможно, все они связаны между собой! В качестве довода приводят отсутствие у них обратной транскриптазы (ОТ), но их ферменты, транспозазы, имеют тесное родство с ОТ. ДНК-транспозоны используют механизм «вырезать и вставить» и осуществляют расщепление и вставку с помощи нуклеазы и интегразы, родственных ретровирусной РНКазе Н и интегразе. Итак, налицо родственные узы.

ДНК-транспозоны «прыгают» в геномах растений и других организмов, но не в геноме человека, который эту способность утратил. ДНК-транспозоны – редкие «ископаемые» в геноме человека, на долю которых приходится лишь 3%, что соответствует 300 000 копий. Но они неактивны. ДНК-транспозоны часто отмечаются у многих растений и составляют до 50%, а в кукурузе 85% соответствующего генома. Соотношение ДНК и ретротранспозонов очень вариабельно; кроме того, у многих растений отмечается большое число ретротранспозонов. ДНК-транспозоны не размножаются, а лишь меняют сайт интеграции без дупликации, что приводит к увеличению числа копий. Вместе с тем некоторые транспозоны способны реплицироваться, что не очень хорошо известно, но важно, так как приводит к дупликации большого числа генов.

Старт и приземление транспозонов после «прыжка» вредят геному! Они могут вызвать повреждения и генетические дефекты генома. Но эти изменения могут оказаться и столь же полезными, как действие токсинов на клетки. Клетки могут лишиться некоторых свойств или приобрести новые. Таким образом, взаимодействие с клеткой следует оптимизировать, так как слишком много «прыжков» дестабилизируют геном, и клетка умрет. В то же время недостаточное количество «прыжков» не вполне информативно и инновационно для клетки, и она также может погибнуть. У эукариотов, в частности у дрожжей, исследователям удалось определить частоту «прыжков». Один из транспозонов дрожжей Ty-1 «прыгает» в одну из 20 000 клеток. «Прыжок» ДНК-транспозона с помощью механизма «вырезать и вставить» может обусловить инновации в силу инсерционного (вставочного) мутагенеза вышеупомянутых генотоксических событий, которые могут привести как к развитию рака, так и к рождению гения. Они обладают двойным действием и могут быть «полезными» и «опасными» одновременно, то есть они, как и ретротранспозоны, способны обусловить инновации. Таким образом, ДНК-транспозоны, видимо, являются самой важной силой, обеспечивающей адаптацию геномов к новым условиям, что может оказаться крайне важным для организмов, у которых при иных условиях вариабельность была бы незначительной, что особенно применимо к некоторым растениям и даже к деревьям. ДНК-транспозоны не могут перемещаться, покидать клетку и всю жизнь проводят на одном месте. Этот период может составлять до 9500 лет, что соответствует возрасту самого древнего известного нам дерева. Их «посещают» компоненты геномов насекомых, жуков, птиц, грибов и других организмов, которые могут нести новую информацию. Возможно, налицо недостаток новой информации, поскольку у растений самое большое число активных ДНК-транспозонов. Недавно было описано ядовитое растение вороний глаз японский (Paris japonica), у которого 150 млрд пар оснований, что в 50 раз превышает геном человека, а самый гигантский из всех известных геномов – геном тюльпана – готова поспорить, что у него самое большое число ДНК-транспозонов.

В отличие от них, у дрожжей (S.cerevisiae и S.pombe) совсем нет ДНК-транспозонов (но много ретротранспозонов). Мне непонятно, почему два вида амеб столь разительно отличаются друг от друга – у одного из этих видов (Entamoeba (E) hystolytica) есть практически только ретротранспозоны, а у другого – только ДНК-транспозоны (E.invadens). Таким образом, трудно вывести правила, определяющие соотношение различных транспозируемых элементов.

Транспозоны проявляют очень высокую активность не только в геноме растений, но также в геноме мух, где они специализируются на «прыжках» на концы хромосом, обеспечивая защиту от эрозии при делении клетки. Поэтому они являются родственниками или предшественниками теломераз (у них сходные структуры), что продлевает концы наших хромосом в период эмбриогенеза. При клеточном делении они защищают наши геномы от потери важнейшей информации.

А теперь удивлю. Транспозоны создали нашу иммунную систему. Каким образом? Транспозоны защищают клетку от родственных транспозонов. Это называется противовирусной защитой, и это – наша иммунная система, защищающая клетку. Механизм действия прост: любой вирус (включая транспозоны) препятствует проникновению в клетку аналогичного вируса. Это гарантирует вирусу успешную репликацию и получение большого количества потомков при ограниченных ресурсах клетки. Таким образом, защита клетки за счет монополии одного вируса благоприятно влияет на репликацию вируса. Вирусы создали противовирусную защитную систему, которая в итоге стала общей иммунной системой клетки-хозяина. Вирусы «научили» клетки не допускать внедрения вирусов. Иммунная система направлена против своих «создателей» или инициаторов, для чего используется простой механизм отрицательной обратной связи.

Не только эукариотические, но и бактериальные клетки защищаются от слишком большого числа транспозонов. Со временем транспозоны должны быть инактивированы, а клеткам нужно аккумулировать инактивирующие мутации для обеспечения эффективных генетических приобретений. Следует отметить, что у клеток существуют механизмы защиты от транспозируемых элементов, поскольку слишком большое количество «прыжков» клетке вредит. «Прыжкам» противодействует сайленсинг (см. главу 9).

Кукуруза «госпожи Мендель».

Генетик Барбара Макклинток изучала кукурузные зерна и была удивлена разнообразием цветов зерен. Когда она анализировала цвет зерен индийской кукурузы, стало понятно, что полученные результаты не коррелируются с открытыми Грегором Менделем законами наследования генов. Она не могла найти этому объяснение. В результате в 1940-х гг. Макклинток открыла «прыгающие» гены – транспозоны. Она перевернула общепринятую в то время концепцию о стабильности нашего генного материала даже до того, как в 1953 г. была открыта двухцепочечная ДНК. Она стала открывателем нестабильности ДНК кукурузы и объяснила это действием «прыгающих» генов, которые повлияли на цвет. Уже в 1944–1945 гг. Макклинток наблюдала явление перемещения генов в клеточных хромосомах, что вызывает мутации и изменение цвета зерен индийской кукурузы. Когда в 1951 г. она докладывала о полученных ею результатах научному сообществу, то столкнулась не только с полным непониманием, но даже с враждебностью и неприятием. Полученные ею результаты были восприняты как ересь. Она опередила время на 50 лет.

В следующие 20 лет «прыгающие» гены или ДНК-транспозоны наблюдали везде, где только возможно, – в дрожжах, бактериях, во всех живых организмах – включая человека, хотя для этого были использованы более сложные процедуры. В наших геномах доминируют ретротранспозоны, в то время как ДНК-транспозоны в геноме человека очень давно оказались инактивированы.

Как это ни странно, но можно даже «видеть» «прыгающие» гены, но только если они воздействуют на гены окраски.

ДНК-транспозоны могут «прыгать» в непосредственной близости от генов окраски и менять их регуляцию, что Макклинток назвала «контроль генов». Другие же исследователи полагали, что изменение цвета обусловлено патогенами. Это тоже верно, вирус действительно вызвал тюльпаноманию (см. главу 8). «Прыжок» может произойти где угодно, но визуально можно выявить лишь изменения в регуляции генов окраски. Редко удается наблюдать невооруженным глазом столь сложные механизмы. Нужно быть таким человеком, как Барбара Макклинток, чтобы понять этот механизм или хотя бы частично в нем разобраться, поскольку он до сих пор полностью не изучен. В 2015 г. на конференциях неоднократно показывали фотографию Макклинток.

Барбара Макклинток открыла эпигенетику – явление, выходящее за рамки генетики, поскольку генетические законы Менделя не объясняют цвет зерен кукурузы. За открытие «прыгающих» генов Макклинток можно было бы назвать «госпожа Мендель», настолько высоко мы должны оценить ее открытие. В настоящее время известно, что эпигенетика основана на химических модификациях ДНК и белков, упаковывающих ДНК, которые затем дерегулируют генную экспрессию. Этот эффект объясняется средовыми изменениями и, как правило, не наследуется. К настоящему времени известны два основных механизма, вызываемые химическими модификациями, такими как присоединение метильных групп к ДНК и изменения в белках гистонов (входящих в состав хроматина) путем ацетилирования. Метилирование промотора, провидчески названное Макклинток «контроль генов», выключает экспрессию гена.

Макклинток не поняли, но самое главное – ее не забыли. Она не получила первую Нобелевскую премию, но внесла весомый вклад в наше представление о контрольных участках в геноме не только кукурузы, но и бактерий. В 1965 г. двое коллег из Парижа – Франсуа Жакоб и Жак Моно были удостоены Нобелевской премии за открытие «модели оперона» в бактериях. Макклинток была по крайней мере их идейным вдохновителем.

Макклинток пришлось пережить горечь разочарования, когда ее научные работы были отвергнуты. Она перестала печататься. Обычно это означает конец карьеры – по крайней мере в науке. Но руководители лаборатории в Колд-Спринг-Харбор Фред Херши, а позднее Джим Уотсон заметили ее достижения и, возможно, предугадали значимость ее исследований. Макклинток получила постоянную лабораторию и работала в ней до конца жизни. Ее офис до самого потолка был завален бумагами. С посетителями лаборатории она была вполне дружелюбна, но не отличалась разговорчивостью. Посетителям приходилось постоянно задавать новые вопросы и поддерживать беседу, в противном случае разговор мог сойти на нет. Макклинток могла практически ничего не говорить, оставаясь при этом дружелюбной, но, когда посетители уходили, она вздыхала с облегчением. В 1983 г. Макклинток получила Нобелевскую премию за «открытие подвижных генетических элементов», открытие «прыгающих» генов. Исследователи начали осознавать значение полученных ею результатов применительно к вирусам и раковым клеткам. Она оказалась третьей женщиной, получившей Нобелевскую премию, и одним из немногих лауреатов, кому не пришлось ее ни с кем делить – она была удостоена этой премии единолично.

На тот момент ей был 81 год. В интервью Макклинток отметила, что никогда не сидела вместе с кем-нибудь в машине. Она была очень нелюдимым человеком. А может быть, страдала аутизмом? Вскоре после того, как ей исполнилось 90 лет, она умерла. Макклинток жила в небольшом деревянном домике, сохранившемся с тех пор, когда китобои приезжали в Колд-Спринг-Харбор за питьевой водой. Над ее квартирой в Хупер Хаус располагалось несколько гостевых комнат для участников конференций, со спартанской обстановкой, как в монашеских кельях. Я любила там останавливаться, когда приезжала на симпозиумы. В этих небольших комнатах время как будто остановилось, замок в туалетной комнате был сломан, и постояльцам приходилось придерживать дверь ногой изнутри – и так десятилетиями! Обстановка комнат была очень простой. Из некоторых комнат можно было увидеть канадских гусей и залив с чередующими приливами и отливами. По утрам Макклинток проходила в толстых носках через лужайку. Так можно представить себе восхождение гения на Олимп или достижение паломниками святых мест. Интересно отметить, что Макклинток не удалось бы обнаружить «прыгающие» гены в геноме человека – их больше нет, по крайней мере это происходит не так, как с ДНК-транспозонами, «прыгающими» в геноме кукурузы. У растений самые подвижные геномы, а геном кукурузы с цветными зернами – идеальный тому пример. Геном кукурузы по-прежнему таит в себе много неожиданного, поскольку он способен в один миг лишиться трети или половины своих генов. Геном кукурузы такой же крупный, как и геном человека, и на 85% состоит из ДНК-транспозонов, в то время как в геноме человека на долю транспозонов приходится лишь 3%, и все они неактивны. Макклинток проанализировала механизм «вырезать и вставить» транспозонов не только в кукурузе, но и в бактериях при помощи фагов, когда ген быстро «перепрыгивает» туда-сюда из генома фага в геном бактерии, как шарик при игре в пинг-понг. Эти небольшие подвижные фаги называются Mu (мю), поскольку они мю-тируют геном своего хозяина. Использование Mu как более оперативной модели для изучения и понимания подвижных элементов было еще одной гениальной идеей Макклинток.

Не только знаменитая кукуруза, но и неприметный и внешне ничем не примечательный полевой сорняк Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля) был одним из первых выбран для секвенирования целого генома растения, поскольку этот геном состоит лишь из 130 млн пар оснований, что меньше по сравнению с геномом кукурузы или пшеницы. Число «прыгающих» генов и повторов относительно невелико, что упрощает процесс секвенирования. Возможно, небольшая частота «прыжков» объясняет небольшой размер генома, а может быть, это вызвано тем, что культивированием этого растения никто не занимался?

Инструменты, необходимые Mu для «прыжков», напоминают аналогичные инструменты, используемые ретровирусами, особенно интегразу. Фаги Mu всегда интегрируется так же, как ретровирусы, в отличие от других фагов, которые не интегрируются в литической фазе, но Mu это делает. Merck Co использовала интегразу фага Mu в высокоэффективном тесте, направленном на скрининг потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ. Mu является моделью для интеграции ретровирусной ДНК в геном бактерий, замещающей ВИЧ! Я не могла в это поверить! Скорость была одним из важных преимуществ, и это не соотносилось с требованиями техники безопасности, которые действуют в лабораториях. В результате был получен один из самых эффективных клинически значимых ингибиторов интегразы ВИЧ, препарат ралтегравир. В высшей степени удивительное сходство между «прыжками» фагов Mu в бактериях и «прыгающими» генами в кукурузе – и так на всем пути до ретровирусов, таких как ВИЧ, – показывает ошеломляющую степень эволюционного консерватизма: от фага в бактерии к геному кукурузы и к ВИЧ у человека! Для меня это тоже удивительно. Меня восхищают исследователи Merk Co, которым пришла в голову столь интересная идея, приведшая к разработке эффективного препарата. Нет более убедительного сходства между ретровирусом и фагом, ВИЧ и Му, чем это.

Еще одна неожиданность: оказалось, что Mu можно использовать в качестве модели для генной терапии, а именно механизма интеграции чужого гена в зародышевых клетках путем ступенчатого разрыва (шаг с динуклеотидными перекрывающимися концами), который заполняется чужеродным геном. Процессы интеграции фагов Mu и ретровирусов схожи до мельчайших деталей, и их изучали в менее опасных и более оперативных Mu системах.

Практически в то же время, когда Макклинток открыла эпигенетику, у кукурузы был выявлен еще один феномен. В 1956 г. канадский генетик Александр Бринк также отметил совершенно необъяснимое наследование – удивительные узоры окраски кукурузных зерен. Этот процесс, который он назвал «парамутация», занимает более одного поколения и не подчиняется правилам мутаций. Генетика без генов! Этот феномен до сих пор остается незамеченным. Он приводит к наследованию приобретенных качеств, включая способность к обучению, – вопрос, однажды вызвавший политические дискуссии. И опять этот феномен не предусматривает непосредственного генетического изменения генов – в отличие от эпигенетических изменений, они носят долговременный характер и сохраняются на протяжении многих поколений. Сейчас ученые стали вспоминать и анализировать удивительный механизм наследственных изменений, не сопровождающихся мутациями. Это явление получило название «трансгенерационое наследование». У ученых вызвало беспокойство то, что, судя по наблюдениям, у полных мужчин рождаются полные внуки, а у полных женщин – полные внучки. А вот почему – узнаете, если будете читать эту книгу дальше. Открою секрет: наследуемые свойства – специальные регуляторы, называемые пивиРНК, передаваемые через сперму! Это перспектива на будущее, и этот вопрос мы обсудим в следующей главе и в конце книги.

Перед лекционным залом в лаборатории в Колд-Спринг-Харбор в память Макклинток установлена небольшая стеклянная витрина, которая отражает ее минималистичный образ жизни – почти нищета: пара пинцетов, посеревший початок кукурузы, художественная открытка, очки – почти ничего. Ее тетради хранятся в библиотеке. Ей бы, вероятно, понравилась такая скромная выставка. После нее остались ее идеи, а не эти вещицы. Просто удивительно, как много можно увидеть, рассматривая кукурузные зерна. Глядя на небольшую оловянную тарелку с разноцветными початками кукурузы, купленными мне в подарок одним моим другом на еженедельном фермерском рынке в Граце (Австрия), я вспоминаю о «прыгающих» генах, открытых Макклинток. Вот они: транспозоны, ретротранспозоны, ретровирусы, вплоть до противовирусной защиты и иммунной системы – все принадлежат друг другу. Всего несколько разноцветных кукурузных зерен поведали нам об истории, насчитывающей несколько миллиардов лет. Нужно сохранять некоторые подобные прекрасные свидетельства истории развития жизни на Земле – к ним, конечно же, относится и разноцветная кукуруза из Граца, а не выпускаемая в промышленных масштабах желтая масса в жестяных банках – в ней нет ничего особенного!

Любому читателю, прочитавшему мою книгу до этого предложения, следует написать мне и сообщить, не нашел ли он в ней ошибок и считает ли он, что в текст нужно внести поправки или корректировки. И тогда этот человек бесплатно получит экземпляр данной книги с моим посвящением.

Отравленные игрушки и эпигенетика мышей агути.

Молодые мамы, будьте внимательны: цветные мыши могут помочь идентифицировать опасные для детей соски-пустышки. Это эквивалентно цветной кукурузе, только у мышей. Мыши не столь разноцветны, как кукуруза: в норме они черные и выглядят здоровыми, а вот больные мыши – рыжие и толстые. Организм черных мышей подавляет заболевания, ожирение, диабет и даже некоторые опухоли. Именно поэтому они используются в качестве животных моделей для исследования воздействия внешней среды. Такие мыши называются мышами агути, по названию гена цвета агути. Глядя на этих двух мышей, которые кажутся совершенно разными – одна рыжая и толстая, а другая черная и стройная, – невозможно себе представить, что они действительно совершенно одинаковы и имеют идентичные гены. Все дело в эпигенетике.

Эти мыши различаются эпигенетическими эффектами, которые обусловлены «транзиентными» (временными) модификациями их ДНК, а не мутацией ДНК. Эпигенетические изменения возникают вследствие факторов окружающей среды. В этом случае канцерогены способны обусловить химические модификации генов цвета путем метилирования ДНК-промотора и/или ацетилирования гистонов. Вследствие этого гены регулируются по-новому, что можно наблюдать в тех случаях, когда под действием гена цвета нормальные мыши становятся рыжими, а модификации гена цвета приводят к тому, что рыжая шерсть становится черной. В случае промежуточных изменений у мышей появляется коричневый окрас.

А теперь я хочу обратить внимание молодых мам: если кормить мышей агути кормом, содержащим канцерогены, в частности бисфенол А, входящий в состав материала, из которого делают многие детские игрушки, соски-пустышки и детские бутылочки в азиатских странах, следующее поколение мышей будет иметь рыжий окрас в силу активации гена цвета. Это сигнал «опасность»! Мыши агути – «тестовые» мыши или биосенсор изменений факторов окружающей среды, таких как канцерогены и токсины, а также мелкодисперсная пыль, химические вещества, психологические факторы или просто возраст – все эти факторы могут обусловить рыжий окрас мышей. Если в корм самке мыши добавить какое-нибудь второе соединение, например витамин В12или фолиевую кислоту, ее потомство снова станет «здоровым» и будет иметь черный окрас. Один фактор питания или внешней среды способен нейтрализовать другой. В данном случае важно понимать, когда именно это происходит и на каком этапе развития, но такой принцип сам по себе – удивительное явление. И все же я бы не рекомендовала давать детям витамины, чтобы компенсировать токсический эффект игрушек, лучше купить менее токсичные игрушки!

Каким образом ядовитые вещества вызывают изменение цвета? Ответ на этот вопрос дали исследования в новой области, которые представляют собой многоступенчатый процесс: токсины приводят к образованию малой регуляторной РНК, метилятора (РНК-зависимой ДНКметилтрансферазы), которая затем метилирует ДНК и регулирует гены цвета.

Макклинток показала, что «прыгающие» гены (или РНК) могут индуцировать эпигенетические изменения и обусловливать формирование разноцветных кукурузных зерен. Она не знала, что у мышей может меняться окрас. Ее бы, вероятно, удивило такое сходство между кукурузой и мышами. И все же существует общий принцип: эпигенетические изменения контроля генов регулируют появление нового цвета. Во время прогулки можно увидеть собак и кошек с белыми метками на кончиках ушей, с белым пятнышком на задней лапе или в белых «носочках». Белые участки кожи также наблюдаются у лошадей и карпов. Это довольно распространенное явление – в этой книге приведено немало таких примеров!

Вы будете удивлены, когда в конце книги узнаете, что некоторые такие явления являются результатом «парагенетики».

Интересно, что одна РНК-молекула может нейтрализовать эффект другой, поэтому два питательных вещества или даже два яда могут нейтрализовать друг друга. И какое отношение это имеет к вирусам? «Прыгающие» гены, транспозоны или ретротранспозоны родственны вирусам и влияют на контролирующие гены, промоторы и, таким образом, на цвет. Транспозоны напоминают «запертые» вирусы, которые не могут покинуть клетку, и оказываются в заточении внутри клетки, поскольку у них нет оболочки, в которой они могли бы перемещаться.

Вся прелесть заключается в том, что белые отметины на ушах или ногах животных указывают на сложные эпигенетические механизмы, средовые изменения генов. Мне не известно, будут ли такие же отметины на ушах у потомства вашей собаки или лошади – если да, то, возможно, транзиентные (временные) эпигенетические изменения превратились в постоянные мутации благодаря усилиям некоторых амбициозных заводчиков!

Спящая красавица, древняя рыба, утконос и карп кои.

Ниже приведено несколько примеров того, как действуют транспозоны в организме различных видов животных. При этом был отмечен случай «воскрешения» одного транспозона из генома лосося с весьма подходящим названием «моряк», которого «оживили» из неактивного древнего транспозона, названного «Спящая красавица» (СК) по имени героини сказки братьев Гримм. Для его реактивации использовали метод, аналогичный описанному выше, когда речь шла о вирусе «Феникс» – реактивированном ретровирусе, который восстановил свою инфицирующую способность после 35 млн лет «спячки». А вирус «Спящая красавица» «дремал» более 10 млн лет. А потом исследователи его «разбудили». В этом случае в лабораторных условиях заменили стоп-кодоны и восстановили транспозон, который вновь приобрел способность к «прыжкам». В 2009 г. в США Международное общество молекулярной и клеточной биологии избрало лососевый СК-транспозон молекулой года, что сделало этот транспозон еще более известным. Сейчас все ждут, что этот транспозон окажется эффективным в генной терапии и будет лишен побочных явлений (или с меньшим количеством?), поскольку, в отличие от ретровирусов, он не интегрируется. И действительно, в 2016 г. был достигнут некоторый прогресс – транспозон использовали для создания зеленой коровы и, что более удивительно, зеленой коровы со светящимися красными глазами. Теперь люди должны получить трансгены или терапевтические гены (не гены цвета) для лечения глазных заболеваний. Поживем – увидим.

Есть такое экзотическое животное, просто набитое «прыгающими» генами, – рыба целакант (African coelacanth) размером примерно с обеденный стол. Ее довольно долго считали вымершей, пока однажды в Южной Африке директор некого музея не увидел ее в рыбацкой сети. С тех пор было замечено еще с десяток особей этого вида. В 2013 г. фотографию рыбы напечатали на обложке Nature. Целакантам около 40 млн лет, и они считаются самыми древними из ныне живущих рыб – живыми ископаемыми. Эта рыба растет очень медленно, почти незаметно около 20 лет, а живет более 100 лет. Возраст рыбы можно определить по органам, обеспечивающим равновесие, – практически так же, как и по годовым кольцам деревьев. Длина генома целаканта составляет 2,9 млрд пар оснований – неожиданно крупный геном, полный повторяющихся последовательностей, которые амплифицируются (до 60%) при отсутствии выраженной диверсификации. Аксель Майер из Констанца, специалист по рыбам cichlids, обитающим в восточноафриканском озере Виктория, является одним из соавторов геномного анализа целаканта. Но даже он не знает, почему геном данной рыбы отличается таким постоянством. У нее не было естественных врагов? Эта рыба особенно интересна тем, что может плавать и бегать, и эта способность должна прослеживаться в ее генах. Я бы пополнила ею свою коллекцию диковинных вещей, кунсткамеру странностей.

Еще одно экзотическое животное – утконос, необычно выглядящее вымирающее австралийское животное. Его геном полностью секвенировали мои коллеги из Института молекулярной генетики Общества Макса Планка (Берлин) и установили, что геном утконоса на 50% состоит из транспозируемых элементов, и некоторые из них очень часто повторяются; кроме того, налицо чрезвычайно много SINE, количество которых, должно быть, многократно увеличилось. Ни у одного другого организма нет такого количества SINE. Причины этого неизвестны. Утконос – животное, находящееся в середине эволюционного пути от птиц к млекопитающим, с утиным клювом, густой шерстью и большим хвостом, в котором может скапливаться жир; он откладывает яйца и вырабатывает молоко. Самец может распылять «яд улитки». Утконосу примерно 100 млн лет. Звучит странно, как научная фантастика. Его геном представляет собой смесь генов различных видов животных.

Еще есть рыба – карп кои, которая внезапно может погибнуть в садке. Этих японских декоративных рыб из семейства карповых поставляют по всему миру для украшения открытых прудов, и они имеют символическое значение – своего рода японская версия священных коров в Индии. Разведение этих особенных ярких рыбок имеет долгую историю. Возможно, внимательный читатель уже готов спросить, не вызвана ли их красочность действием «прыгающих» генов, как в случае с окраской зерен кукурузы? Это именно то, что я предполагала, поскольку у заводчиков возникают проблемы из-за постоянного изменения цвета рыбок из поколения в поколение, который не наследуется должным образом. Обусловлен ли этот явный знак – подозрительная схожесть с эффектом, наблюдаемым у кукурузы и мышей агути, а также у полосатых тюльпанов (см. главу 8), – тоже эпигенетическими изменениями?

Почему же карпы кои неожиданно погибают? Они погибают из-за герпесвируса кои. Может быть, у них слишком высокая плотность популяции? Могла ли какая-нибудь новая рыба быть носителем вируса и заразить всех остальных? Нет, все дело в том, что человек изменил их среду обитания: выпрямил границы озера, убрал ступенчатые рыбоходы, чтобы рыба не могла плыть вверх по течению и откладывать икру. А это стресс для карпов кои! Он влияет на их иммунную систему и приводит к активации герпесвирусов. В Германии ступенчатые рыбоходы для лосося стали обязательными, чтобы рыба могла выпрыгивать из воды, поднимаясь вверх по течению. У наших карпов такие же привычки и такие же проблемы. Известно, что под действием стресса у нас на губах активизируется герпесвирус и появляется герпесная лихорадка – то же самое происходит и с рыбами. Стрессовый фактор внешней среды действует на реальные вирусы и эпигенетические свойства.

Забор со щелями.

Просто удивительно: лишь 2% нашего генома кодирует белки. А что же остальные 98%? Эта часть генома обеспечивает нормальное функционирование 2% генов, кодирующих белок. Регуляторные, или некодирующие нкРНК происходят из этих 98% генов. Австралийский ученый Джон Маттик много лет подчеркивал значение данного рода нкРНК. На графике, приведенном в статье, опубликованной в Scientific American, он показал, как по мере повышения сложности организации живых организмов от бактерий, одноклеточных организмов, грибов, растений к позвоночным количество регуляторных РНК увеличивается от нуля до 98% суммарного количества РНК. Мы находимся на верхней планке этой шкалы. Почему у сложноорганизованных животных гораздо выше уровень нкРНК? Ответ на этот вопрос прост: это нужно для обеспечения более сложной организации живых существ.

Наша геномная ДНК кодирует в общей сложности 20 000 генов. И все же, как это ни странно, наш геном уступает геному бананов, в котором примерно 35 000 генов, а в геноме кукурузы 50 000 генов, равно как и в геноме пшеницы и тюльпанов. Что касается генома пшеницы, выделено три родственные хромосомы, как будто они являются результатом процедуры умножения. Хлеб, испеченный из муки, получаемой из пшеницы, у которой всего одна хромосома из трех, имеет горький привкус. Из такой муки сложнее выпекать хлебобулочные изделия. Возможно, гигантские геномы являются следствием длительной селекции и культивирования. Хотя из этого правила вполне могут быть исключения.

У полевого цветка резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana) 28 000 генов – вероятно, никому не приходило в голову культивировать этот «бесполезный» сорняк. Поэтому его геном остался мелким. Затем следует червь C. elegans, имеющий 23 000 генов. С точки зрения числа генов человек находится не в верхней части диапазона. Таким образом, у нас с нашими 20 000 генов их меньше, чем у невзрачного цветка резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana) и у амебы.

У обезьян и мышей столько же генов, сколько у нас. Создается впечатление, что такое утверждение не имеет должных оснований. Число генов, безусловно, не коррелирует с уровнем интеллекта! Во время общественного обсуждения этой проблемы возник непростой вопрос: почему у человека так мало генов? У нас их не так уж и мало, просто они длиннее. У всех других видов живых существ гены короче. У человека самая длинная ДНК – в среднем 160 000 пар оснований из расчета на один ген. Таким образом, у тюльпанов, кукурузы и бананов генов больше, чем у нас, но эти гены короче и «менее информативны». У риса и кукурузы гены примерно на 1/10 и 1/5 короче по сравнению с нашим геном, состоящим из 10 000–50 000 пар оснований из расчета на один ген. Гены бактерий состоят примерно из 1400 пар оснований, а у многих вирусов самое маленькое число – около 1000 пар оснований из расчета на один ген. В контексте данной книги целесообразно помнить о небольшой численности вирусных геномов, поскольку существуют и исключения – гигантские вирусы (см. главу 6).

Есть странный факт: у скандинавской ели, самого древнего из известных на Земле деревьев, которому 9500 лет, геном в шесть раз больше нашего. Тем не менее у этого дерева число кодирующих генов столь же мало, как в геноме полевых цветов. Многие из его генов являются повторяющимися, но никаких инноваций не наблюдается. Неужели скучная жизнь длится дольше? Я пополню образцом этой ели свою коллекцию диковинных вещей.

У мух был описан довольно эффективный процесс очищения от ненужного генного материала, и ученые даже заговорили о механизме «наведения порядка» применительно к генам. Для очищения генов требуется энергия. Но что дешевле и экономичнее: хранить ненужную ДНК-информацию в геноме или удалить ее? Является ли хранящаяся информация равноценной тому, что часто называется «мусорной ДНК»? Это ДНК, полная неизвестных или потенциально бесполезных последовательностей? Удаление избыточной ДНК недостаточно изучено.

Если представить, что мне нужно срочно навести порядок в подвале дома, я все равно предпочту не выбрасывать все подряд, поскольку расходы на хранение этих вещей не слишком велики. Я знаю, что весь этот «хлам» может когда-нибудь понадобиться. Во время войны, когда ничего невозможно было достать, платья шили из занавесок. Вероятно, избыточные ДНК могут оказаться полезными в период дефицита и использоваться как резервные копии. Очистка была бы намного более трудоемкой.

Какую функцию в геноме человека призваны выполнять чрезвычайно крупные гены, если не хранение информации, кодирующей белок? А ответ такой: хранение регуляторной информации, управление, организация и комбинации генных участков для образования новых генов!

Большие гены полны интронов, чередующихся с экзонами, которые являются промежутками между экзонами. Выше мы использовали в качестве модели интронов и экзонов забор, состоящий из столбов и пустых промежутков между ними. Интроны экспрессируют регуляторную некодирующую, или нкРНК, которая предназначена не для кодирования белков, а для их регуляции. Гены человека состоят в среднем из семи экзонов/интронов, при этом интроны могут быть очень длинными, в сотни раз длиннее экзонов, что очень напоминает забор с большими пустыми промежутками между столбами (или открытые ворота).

А теперь мы подошли к важному моменту: экзоны могут комбинироваться путем сплайсинга, обусловливая сложную организацию, особенно из-за того, что наши гены самые крупные. Это делает человека более высокоорганизованным живым существом по сравнению со всеми другими.

Когда открыли ДНК, представлялось, что один ген кодирует один белок, и это воспринималось как само собой разумеющееся. Такое утверждение некорректно для нас, людей, чего нельзя сказать о вирусах, поскольку у вирусов нет интронов. Несмотря на это, они тоже способны к сплайсингу, но только за счет нового комбинирования участков экзонов – это опять-таки является одним из минималистичных и экономичных свойств вирусов. И все же вирусам тоже необходима регуляция генной экспрессии. С помощью электронной микроскопии был открыт сплайсинг в вирусах, при котором визуально определялось образование петлеобразных структур из участков вирусного генома. Благодаря сплайсингу становится возможным использование различных «рамок считывания» – принципа, действующего на всех уровнях от вирусов до нас.

У вирусов число некодирующих нкРНК минимально, почти равно нулю. У бактерий этот показатель составляет примерно 10% (в некоторых отчетах можно найти и 0%), у дрожжей – 30%, у C. elegans – 70%, у мух – 85%, а у мышей и человека – 98%. Можно выразить это иначе: у вирусов белок-кодирующая информация составляет практически 100%, а у человека – только 2%. Поэтому можно сказать, что наш геном регулируется другими 98%, соответствующими исполнительной и законодательной власти в политической системе. Совершенно верно, а определение «исполнительный» (executive) похоже на понятие «экзон» (exson). Означает ли это, что нами управляет очень рассудительная законодательная власть? Нет, все как в политике. В Швейцарии семь человек представляют исполнительную власть и 200 человек – законодательную власть / регуляторные органы. Похоже, наша генная регуляция осуществляется в пропорциях, сопоставимых с соотношением ветвей власти в самой демократичной стране мира, по крайней мере с точки зрения швейцарцев!

Законодательная власть – интроны, они определяют программы, осуществляют временну́ю и пространственную координацию, разработку, дифференциацию, специализацию, программы роста и гибели клеток (апоптоза), равно как и адаптацию, иммунный ответ, инновации и максимальную эффективность функционирования организма человека. И в заключение отмечу: комбинаторное соединение генетических участков, осуществляемое путем сплайсинга, обусловливает специфичность человека как вида. И в этом наша сила!

Проект ENCODE, направленный на формирование представления о «мусорной ДНК».

Что происходит с 98% генома человека? 2% генома кодируют белки, а что делает оставшаяся часть, мы не знаем. Поэтому в рамках проекта «Геном человека» был инициирован проект ENCODE («Энциклопедия элементов ДНК»). Целью ENCODE является выяснение, что происходит в «пустынных участках» – так авторы проекта назвали некодирующие (нк) «пустые» пространства, расположенные между кодирующими участками. Только 2% ДНК приписываются к белкам. Большая же часть ДНК, 98%, экспрессируются как некодирующие нкРНК, которые выполняют регуляторную функцию, направленную на организацию оставшейся части РНК, экспрессию белков. Пустынные участки содержат короткие и длинные регуляторные элементы, в частности энхансеры, репрессоры, сайленсеры, с активными и неактивными сайтами, инсуляторы, промоторы, находящиеся рядом с генами, «инструкции» по процессингу (тримминг, обрезка РНК), химическим модификациям, таким как метилирование ДНК и ацетилирование хроматина (возможно также, фосфорилирование и прочие модификации) и РНК-транскрипты генов. Одним из недавних открытий стало выяснение роли «инсуляторов» (insulators, «изолирователи»), название которых говорит само за себя и подразумевает блокировку участков, расположенных между промотором и энхансером. Как действует этот механизм, до сих пор неясно. Задача заключается в том, чтобы понять, каким образом и при каких обстоятельствах проявляется активность гена. Кроме того, будет проведен анализ интенсивности сигнала (насколько активен ген), насколько сильно он экспрессируется и сохраняется в процессе эволюции. Но это не относится к вирусам, поскольку они не консервативны, в связи с чем, вероятно, понадобятся дополнительные исследования.

В последнее время обработка огромного объема данных сопровождается астрономическими цифрами, которые упоминаются и в голландском геномном анализе. Представьте себе нагромождение бумаги высотой 15 м и длиной 35 км, исписанной только четырьмя буквами A, G, T и C в порядке, который пока никто не понимает: объем написанного – 15 Тбайт (или 15 000 Гбайт), и все это нужно понять как текст, разбить на предложения, главы, заголовки и параграфы. Общая длина генома человека 3,2×109 нуклеотидов.

Сейчас, спустя много лет после того, как в 2003 г. начался проект ENCODE, опубликовано более 2500 работ. Поразительно, но некоторые из них озадачивают. У нас всего 20 000 генов, однако в этих публикациях описываются 70 000 промоторов – исходные последовательности и регуляторные участки, расположенные перед генами. Почему же промоторов настолько больше, чем генов? Кроме того, было выявлено 40 000 энхансеров – более отдаленных от гена участков с трансграничными эффектами дальнего действия, не кодирующих белки. Похоже, на пустынных участках, где производится большое количество регуляторных нкРНК, наблюдаются мутации, приводящие к заболеваниям. Были выявлены дефектные регуляторные элементы, провоцирующие болезни. Дерегуляция (ослабление контроля) экспрессии генов часто означает рак. Действительно, как оказалось, болезни обосновываются в некодирующих областях.

В настоящее время ДНК проанализирована лишь на 10%. К концу 2014 г. 440 ученых из 32 групп, работающих со 147 типами клеток в соответствии со стандартными протоколами, провели 1648 экспериментов.

Итак, можно ли сейчас дать определенный ответ, какая доля ДНК приходится на «мусорную» часть? Нет. Как выяснилось, пустынные участки ДНК на 80% функционально активны, а 75% таких участков транскрибируется в РНК не для производства белков, а для регуляции.

Таким образом, бóльшая часть ДНК выполняет какие-нибудь функции. Многие вирусные последовательности оказываются поврежденными настолько, что похожи на «мусор», но часто они все равно выполняют какую-нибудь функцию и их ДКП ранее упоминались как остаточные последовательности, являясь промоторами для прочих генов. Другие же последовательности, возможно, находятся на пути к исчезновению и поэтому вполне могут представлять собой «мусор». Эволюция идет своим чередом и никогда не останавливается! При проведении генетической диагностики нужно иметь в виду, что геномы двух «нормальных» людей отличаются на 0,5%, что составляет 16 млн пар оснований (это число недавно увеличилось в пять раз) из общего числа генов 3,2 млрд. Исходя из этого, нужно определить последовательности, ассоциированные с заболеваниями. Какой из однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) указывает на заболевания, а какой ничего не значит? Этот вопрос требует решения. Чтобы преодолеть соотношение «сигнал–шум», нужно разработать новые технологии.

Вероятно, существуют рациональные способы найти ответы на все или на некоторые из этих вопросов. Крейг Вентер нашел более дешевый и быстрый способ проанализировать геном человека, сократил расходы на исследовательскую работу на несколько порядков и сэкономил человечеству лет 10 работы. Сможет ли он или кто-нибудь другой повторить его успех в рамках проекта ENCODE? Надеюсь. Все данные, получаемые в указанном проекте, становятся предметом гласности, и недавно были организованы курсы по обучению работе с этими данными. Все могут помочь – если смогут!