3. Ретровирусы и бессмертие.

Обратная транскриптаза – персональная ретроспектива.

Один журналист спросил Хоуарда Темина по случаю вручения ему Нобелевской премии в Стокгольме в 1975 г., за что тот получил эту премию. «Я не могу этого объяснить, вы потеряете нить рассуждений через 30 секунд, – ответил он. – А почему бы вам вместо этого не написать “Бросайте курить?” Это гораздо важнее!» Он был активистом движения против курения и даже говорил об этом в своей благодарственной речи в присутствии короля Швеции, но, как это ни печально, он умер от рака легких, хотя никогда не курил.

Темин даже не пытался объяснить непрофессионалам свое изобретение. А я все же попробую. Я была свидетелем того, как все происходило. Он открыл обратную транскриптазу (ОТ) – фермент, необходимый для репликации ретровирусов, в частности ВИЧ. Этот фермент играет гораздо более важную роль, чем просто фермент для репликации вируса, и, как прогнозировал Темин, он играет важную роль в композиции нашего генома. Эти родственники ретровирусов амплифицируют наши гены, изменяют набор генов наших геномов, но никогда не покидают клетку. В настоящее время даже существует гипотеза, согласно которой РНК в процессе эволюции превратилась в ДНК именно благодаря обратной транскриптазе. Когда я начала исследования обратной транскриптазы, о ней еще ничего не знали, а сейчас, 45 лет спустя, ее рассматривают в качестве одного из наиболее распространенных и, вероятно, самых важных белков, известных в биологии.

Как я стала свидетелем открытия транскриптазы? Тема моих докторской и кандидатской диссертаций – «Репликация вирусов». Хорошо помню некоторые детали. В конце 1960-х я приехала из Беркли (США), где, собрав все свое мужество, оставила физику и резко переключилась на относительно неизвестную для себя область знаний – молекулярную биологию. Это случилось в то время, когда кампус был охвачен студенческими волнениями. Вернувшись в Германию, я искала проект для защиты кандидатской диссертации.

Гюнтер Стент, знаменитый генетик, переехавший из Берлина, пригласил меня к себе в офис в Беркли – у него на столе стоял макет здания Общества Макса Планка в Тюбингене, и он предложил мне поехать туда поработать. Именно так я и поступила: за день рассмотрела три темы и решила выбрать ту, которая показалась мне наиболее интересной и которая, вероятнее всего, могла быстро дать результаты. Восхитительный вид на горную цепь Швабская Юра оказал на мое решение большое влияние ненаучного свойства. Я привнесла в вирусологический институт молекулярную биологию. Однако сначала мне пришлось преодолеть трудный барьер. Мне нужно было научиться изолировать вирус из живых цыплят, которых я заразила вирусом миелобластоза птиц (ВМП), индуцирующим одно из заболеваний крови. Эта процедура предусматривала забор образцов крови непосредственно из сердца цыпленка при помощи гиподермичной иглы – сегодня такой метод не разрешили бы. Предметом изучения моего проекта был механизм репликации этого вируса. Однако несколько месяцев движения вперед в проекте не наблюдалось.

Затем на одной из знаменитых лекций, которые проходят по понедельникам в Обществе Макса Планка в Тюбингене, я узнала от Фридриха Бонхеффера (он только что вернулся с международной Гордоновской конференции), что Хоуард Темин открыл обратную транскриптазу. Некоторые посмеивались и говорили: «Он все еще твердит об этом». Мой проект застопорился, и я решила протестировать обратную транскриптазу. На следующее утро в 8:00 я стояла у двери кабинета Хайнца Шаллера, специалиста по репликации ДНК, так как хотела взять у него «строительные блоки» для ДНК (включая блоки с радиоактивными метками), а не для РНК. Их использование было единственным – но очень важным – отличием данного проекта от моих предыдущих исследований. Я располагала большим количеством вирусов, полученных от цыплят путем проведения пункции сердца. Вечером мы с Шаллером и другими коллегами собрались в помещении, где находился детектор радиоактивности, чтобы проанализировать полученные результаты: было получено невероятное количество ДНК с радиоактивными метками, и показания счетчика зашкаливали. Если иметь нужную идею, можно за один вечер провести эксперимент, достойный Нобелевской премии. Но, к сожалению, у меня не было нужной идеи! Я искала не тот фермент – РНК-полимеразу вместо ДНК-полимеразы. Через несколько недель все блоки для построения ДНК (нуклеотиды) были проданы в разные страны мира. Неионный детергент, используемый для разрушения вируса, доставали на автозаправочных станциях – эта информация разлетелась по миру благодаря сарафанному радио, и в скором времени детергент уже было не достать. Похоже, весь мир занялся исследованием обратной транскриптазы!

Самому же Темину пришлось пережить скептицизм коллег, по мнению которых, идея о том, что ДНК является промежуточным звеном для РНК вируса, была невероятной. Но, основываясь на этих экспериментах, Темин пошел еще дальше и предположил, что промежуточная ДНК, которую он определил как ДНК провируса, интегрируется в ДНК клетки-хозяина. ДНК вируса может замаскироваться в виде ДНК провируса в ДНК клетки-хозяина, что помогает ей выжить. Так появились понятия «ретровирус» и «обратная транскриптаза». Эти эндогенные вирусы и связанные с ними структуры способствуют активному размножению нашего генома, и на 50% благодаря ОТ. Но обратная транскриптаза способна на гораздо большее, и вы в этом убедитесь.

Как получить ДНК из РНК? Нужно сделать больше одного шага? Да, и использовать молекулярные «ножницы», нуклеазу, фермент, называемый рибонуклеазой Н или сокращенно РНКазой Н (подробнее остановимся на этом вопросе: вирус проникает в клетку, и РНК вируса сначала копируется с помощью обратной транскриптазы в ДНК посредством гибрида РНК–ДНК. После этого считается, что РНК выполнила свою функцию, и, чтобы получить двуспиральную ДНК, ее нужно удалить из гибрида при помощи РНКазы Н).

Во время ланча в Обществе Макса Планка в Тюбингене мне рассказали о студенте Вернере Бюсене, который изучал тимус телят. Обычно он ходил на скотобойню, собирал тимусную ткань и выделял из нее РНКазу. Но не имел представления о том, для чего предназначен этот фермент, – собственно, этого никто не знал. Только через несколько месяцев мне в голову пришла идея, что такой фермент с эффектом «ножниц» может использовать вирус, чтобы избавиться от РНК. Я проверила эту идею. Мой коллега дал мне несколько драгоценных РНК с радиоактивными метками, и я с большой долей уверенности могла доказать наличие активности РНКазы Н после растворения РНК. (Позднее я выяснила, что РНКаза Н объединена с обратной транскриптазой, образуя одну молекулу, и эти составляющие связаны и перемещаются вместе. ОТ копирует ДНК, а несколько нуклеотидов РНК позади РНКазы удаляются – очень эффективный механизм.) Открытие такого расщепляющего фермента (РНКазы Н) в ретровирусе позволило мне напечатать статью в журнале Nature, получить кандидатскую степень, приглашения выступать с лекциями в США и обзавестись на удивление большим количеством соавторов. Все они утверждали, что внесли свой вклад в разработку концепции и подготовку статьи. Как я узнала позднее, стоящие идеи приходят в голову сразу многим ученым. И еще я испытала разочарование, поскольку начиная с этого времени мне практически никогда не удавалось попадать в растущий поток публикаций по этой теме. Меня всегда кто-то опережал.

Существует еще один аспект. Меня часто спрашивают: откуда ученые берут идеи и как делаются открытия? Приведу один пример: сходите на ланч с другими учеными, задавайте вопросы, слушайте и учитесь! Только не ходите в фастфуд!

Очень известному позднее вирусологу Питеру Дюсбергу, который был замечательным ученым и преподавателем в Беркли в годы моего пребывания там (а известен он был не только тем, что приклеивал на инкубатор для выращивания культур тканей довольно пикантные фотографии красоток), не удавалось обнаружить в мышиных вирусах фермент РНКаза Н, удаляющий РНКазу. А я изучала куриный вирус. Дюсберг утверждал, что этой РНКазы Н в мышиных вирусах нет. Поэтому, с его точки зрения, мои наблюдения представляли собой единичное исключение, характерное для птичьего вируса. К счастью для меня, он опубликовал свою точку зрения. Это было самое лучшее, что для меня, молодого ученого, могло произойти, поскольку это позволило мне доказать неправоту ученого с мировым именем. Мы с ним дружили всю жизнь. Он часто заходил ко мне, когда приезжал в Берлин к матери; мы даже устраивали крупномасштабные подиумные дискуссии об опасности самого важного ретровируса – ВИЧ и практически никогда не сходились во мнениях.

Мне очень повезло: у меня был значительный объем мышиного вируса. Отчасти это произошло благодаря клеткам «Эвелин» – устойчивой клеточной линии, названной так в честь создавшего ее оператора. Она содержит достаточно много вируса для решения довольно неоднозначных научных вопросов и проведения экспериментов, результатов которых хватит на написание нескольких статей. Однако Эвелин дорого заплатила за это – вследствие пипетирования у нее возникли проблемы с суставами.

Позже, уже работая в Институте Роберта Коха в Берлине, я обратила внимание, что очищенная обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц, а не из одной, как ожидалось. Можно было наблюдать две полосы в эксперименте (путем окрашивания белков после разделения их по размеру в электрическом поле). На симпозиуме, который проводился на базе лаборатории в Колд-Спринг-Харбор, несколько докладчиков – известных ученых охарактеризовали вторую полосу как кофактор клеточного происхождения. Было известно, что у прочих полимераз есть кофактор – сигма-фактор. Однако эти выводы носили, скорее, предположительный характер и были основаны на аналогии, а не на экспериментах. Собравшись с духом, я подошла к Джиму Уотсону, который в то время руководил этой лабораторией, и сказала, что наблюдала увеличение нижней полосы за счет верхней. Нижняя полоса характеризует продукт деструкции – это не фактор клетки-хозяина. Если добавить немного протеазы (которая стимулирует процесс разрушения), процесс ускоряется. «У вас есть слайды? Завтра выступите по этой теме». Что я и сделала. Через три месяца он позвонил мне в Институт Коха в Берлине. До сих пор удивляюсь, где он взял мой номер телефона. «Скажите, разве не вы рассказывали о расщеплении обратной транскриптазы и ее разбивке на две субъединицы? А сейчас совершенно неожиданно в сборник симпозиума для публикации представлено четыре материала на эту тему». Никто даже не вспомнил об инородном сигма-факторе клеточного происхождения! И ни слова о полученных мной результатах! В 1975 г. все это было опубликовано в сборнике материалов симпозиума, и моя статья тоже, но, конечно, и другие, «скорректированные». С тех пор он никогда обо мне не забывает. «Привет, Карин», – говорит он в свои 85 с лишним лет и приглашает на лобстера. Уотсон написал книгу «Избегайте занудства»[8], в которой раскрывает секрет своего успеха: «Не нужно быть самым умным среди собеседников, собравшихся за столом». Нужно садиться рядом с теми, кто умнее вас, – именно так я поступила, и это было абсолютно правильно.

Будучи физиком по образованию и аспиранткой, я не умела выделять фермент ОТ. Я снимала комнату в St. Joseph’s Home в Цюрихе (там на прикроватной тумбочке лежала Библия). Мне разрешили наблюдать, как в Институте Чарльза Вайссмана при Цюрихском университете выделяют фермент. Я сидела в холодном помещении – при более высокой температуре фермент теряет активность – и, дрожа всем телом, наблюдала, как оператор проводил изоляцию. Вайссман изолировал Q-бета репликазу из бактерий (об этом пойдет речь в последней главе). После этого я вернулась домой, в Общество Макса Планка в Тюбинге, чтобы выделить из птичьего вируса фермент ОТ, реплицирующий вирус. Мне нужно было научиться у Вайссмана рассчитывать объем материала на входе и выходе, иметь представление о количественных показателях и проверять их баланс. И, какими бы исследованиями после этого мне ни приходилось заниматься, я никогда не забывала количественно определять свои действия. Вместе с Институтом Вайссмана мы разработали несколько моделей репликации вируса при помощи ОТ и РНКазы Н и сделали несколько совместных публикаций. Но процесс репликации ретровируса оказался гораздо сложнее, чем мы предполагали, то есть таким, каким его методом проб и ошибок создала природа. Через несколько лет ко мне обратилась Boehringer Company и заказала большой объем фермента ОТ для продажи: все лаборатории хотели использовать его для получения ДНК из РНК. Проблема, касавшаяся двух субъединиц, оказалась очень значимой, но ее удалось автоматически решить в процессе хранения фермента, как это произошло в моей морозильной камере. Я была рада, что мне удалось компенсировать институту в Берлине затраты на проведение исследования.

Примерно через 15 лет, в начале 1980-х гг., был открыт ВИЧ, самый значимый ретровирус, и мы начали анализировать репликативные ферменты ОТ/РНКазу Н ВИЧ. В настоящее время я пытаюсь «убить» ВИЧ путем активации (а не ингибирования) «ножниц» РНКазы Н в вирусных частицах вне клетки и надеюсь, что, может быть, это в итоге приведет к разработке терапии и предотвращению продуцирования вируса и распространения заболевания. Когда мы начали работать с ВИЧ, то собирались приготовить моноклональные антитела, разработанные незадолго до этого и подходившие для очистки и определения свойств различных веществ в силу их высокой специфичности. Для первого этапа требовалась иммунизация мышей очищенной ОТ. Маловыраженные признаки «ОТ-ВИЧ» на клетке для мышей вызвали панику в берлинском Обществе Макса Планка. Инспектор, прилетевший из Мюнхена, чтобы разобраться в этом вопросе, не решился пожать мне руку – так боялся вируса. Скандал усилился после чистки клетки, когда ее в том же виварии поставили в другое место, что – абсолютно безосновательно – было истолковано как попытка удалить, «спрятать вещественные доказательства». Для того чтобы реабилитироваться, позднее мне разрешили приготовить обратную транскриптазу, которую вместе с другими (рибосомными) белками, поставленными институтом, должны были доставить на околоземную орбиту, чтобы посмотреть, как происходит процесс кристаллизации в условиях пониженной гравитации. К сожалению, эксперимент закончился неудачей. Как выяснилось намного позже, кристаллизация происходит только в том случае, если фермент зафиксирован в определенной структуре специальным препаратом. А в моем случае он был слишком «гибким»! Кристаллы необходимы для разработки противовирусных препаратов.

Позднее в своей исследовательской деятельности мне приходилось сталкиваться с тем, что люди боятся нашей работы. Так было в случае с гриппом, ТОРС и вирусом рака, поскольку заражались не только коллеги, но и их сослуживцы, и часто мужья и жены. Подозрительность была вполне оправданна, поскольку действительно было несколько инцидентов – в Китае, например, из лаборатории с высокой степенью биозащиты пропадал вирус ТОРС (три раза!); кроме того, однажды исчезло несколько лабораторных лягушек (Xenopus laevis), и это стало огромной проблемой в Калифорнии.

ОТ – специфическая характеристика ретровирусов, что удивило ученых, поскольку никто не ожидал, что РНК может транскрибироваться в ДНК для репликации. Это привело к пересмотру «центральной догмы» молекулярной биологии, согласно которой биосинтез ДНК – РНК – белок происходит в ходе двух последовательных процессов, транскрипции и трансляции соответственно. Хоуард Темин и независимо от него Дэвид Балтимор показали, что возможен и обратный процесс: ДНК может биосинтезироваться из РНК. Такую реверсивную транскрипцию впоследствии назвали «обратной» транскрипцией, в силу чего фермент получил название «обратная транскриптаза». (Интересно отметить, что ОТ может осуществлять две реакции: «превращать» РНК в ДНК и ДНК в ДНК, а изначальная РНК должна быть удалена при помощи РНКазы Н между этими двумя реакциями. В итоге получается двуспиральная ДНК.).

Открытие реверсивного (обратного) потока информации стало большой неожиданностью для ученых. Следовательно, ДНК может интегрироваться в ДНК генома клетки-хозяина и передаваться на протяжении всего жизненного цикла клетки при делении как клеточный ген. Ретровирусы обычно не вызывают лизис своей клетки-хозяина и не уничтожают ее, они «отпочковываются» от клеточной мембраны. Если исходить из того, что в процессе эволюции сначала появилась РНК, а потом ДНК, то понятие «обратная транскриптаза» окажется некорректным. Шаг от РНК к ДНК носит не реверсивный, а прямой характер. Строго говоря, правильно было бы назвать это явление «реальная транскриптаза»! В этом случае даже не пришлось бы менять сокращенное название на английском языке (RT)[9], однако никто в таком изменении не заинтересован.

В настоящее время, когда, фигурально выражаясь, все возможные геномы секвенированы, самое большое удивление вызвало количество находящихся вокруг нас обратных транскриптаз. Они присутствуют во многих организмах, во всех эукариотах (животных и растениях), а также в археях, бактериях, ретротранспозонах, сплайсосомах и в странных химерных мультисателлитных ДНК (msDNA), а также в иммунной системе человека и бактерий. У одних только бактерий существует более 1000 различных видов обратных транскриптаз. Для чего они предназначены? В клетках млекопитающих нам известны ретротранспозоны, которые кодируют эти обратные транскипты, необходимые для действия механизма «копировать и вставить» клеточной ДНК, который будет описан ниже (ретротранспозоны напоминают упрощенный вариант ретровирусов). В 1978 г. один из ученых, открывших обратную транскриптазу, Дэвид Балтимор, организовал встречу, на которой кто-то из участников охарактеризовал существование обратной транскриптазы у мух: «Насколько мне известно, в организме мух нет ретровирусов». И лишь в настоящее время, много времени спустя, нам стало известно, что у мух тоже есть обратная транскриптаза, источником которой являются не ретровирусы, а их родственники, ретротранспозоны – предшественники или процессированные «деформированные» ретровирусы, которые широко распространены и существуют, в частности, у мух. Они чрезвычайно широко распространены. Так уж случилось, что ретровирусы как частный случай были открыты первыми!

Итак, мы выяснили, что обратные транскриптазы связаны не только с ретровирусами. Поскольку фаги, которые по большей части содержат ДНК, тоже относятся к вирусам, можно себе представить, что в процессе эволюции они в свое время имели РНК и только позднее ДНК-геномы, а в промежутке обладали ретровирусоподобными свойствами. То есть вполне можно ожидать открытия и «ретрофагов». Я сформулировала эту идею. Но, насколько мне известно, несмотря на интенсивные исследования, в которых я тоже участвовала, существует только один «ретрофаг», являющийся прибежищем одной из обратных транскриптаз (см. ниже).

Известно, что обратная транскриптаза – ключевой фермент в биологии. Вероятно, фермент ОТ даже в первую очередь «изобрел» ДНК и, безусловно, сыграл важную роль в формировании геномов, включая наш собственный, в процессе эволюции, которая насчитывает, как сейчас признано, более 100 млн лет. Возможно, изначально существовал более простой и примитивный предшественник ОТ. Я подчеркиваю значимость обратной транскриптазы не (только) потому, что я специалист именно по данному ферменту и сужу пристрастно, а еще и потому, что есть новые свидетельства очень важной роли этого фермента, который является одним из наиболее распространенных белков и даже ведущим ферментом в проекте по изучению образцов, забранных из океана, и составляет 13,5% всех содержащихся в планктоне белков, даже через 45 лет. А почему? Ретровирусы, ретротранспозоны, механизм «копировать и вставить» подходят друг к другу и формируют геномы, стимулируя эволюцию. ОТ – молекула номер один, равно как и РНКаза Н, о которой речь пойдет в следующей главе.

РНКаза Н – молекулярные «ножницы».

Чаще всего цитируется моя работа, опубликованная не в самом известном журнале. Но это – нетипичный случай. Частота цитируемости является важным критерием качества статьи, что, очевидно, может быть и не совсем так. Я открыла «ножницы», рибонуклеазу Н, или РНКазу Н в ретровирусах животных, а потом еще и в ВИЧ. (Она играет важную роль в процессе репликации ретровирусов от РНК до двуспиральной ДНК: РНК нужно удалить из гибрида РНК–ДНК, для чего используют рибонуклеазу Н (РНКазу Н), обладающую специфичностью к гибриду.) В 1990-х мне позвонили и спросили: «Вы доказали, что данный фермент действительно необходим для репликации вируса?» Звонили из компании, которая была заинтересована в разработке ингибитора РНКазы. Они только собирались разрабатывать препарат против важного вирусного компонента, поскольку разработка лекарства требует серьезной работы и затрат. «Да, конечно, – сразу же ответила я. – В противном случае образование двуспиральной ДНК было бы невозможно – РНК нужно удалить, как только она скопируется в односпиральную ДНК». Однако я поспешила с ответом. «Этому есть формальные подтверждения?» – «Нет!» Мне никогда не приходило в голову, что их нет. Для этого следовало бы осуществить мутацию РНКазы Н (это означало бы уничтожение ее активности) и показать, что вирус более не способен реплицироваться. Это была бы мутация, приводящая к «утрате функциональности». Я не могла провести такой эксперимент, поскольку для этого необходима инфицированная копия ДНК (клон) ВИЧ, направленный мутагенез и тестирование инфицированного вируса-мутанта, что можно сделать только в лаборатории с высоким уровнем защиты (самым высоким, четвертым, уровнем биозащиты). Такую работу могла выполнить только группа компаний Wellcome Co. в Лондоне. Я позвонила им, и мы договорились о сотрудничестве. Для мутагенеза мы искали последовательности генов, которые были описаны в бактерии E. coli и были известны. Следовательно, было просто найти важные сайты для мутации, поскольку они были «консервативны». Такой подход сработал. Как это ни странно, меня тогда нисколько не удивляло, что РНКаза Н хорошо работает и с бактериями. Какая может быть взаимосвязь между бактерией и одним из ретровирусов человека? В те годы, в отличие от настоящего времени, я не рассматривала эволюционный аспект! (Принято считать, что для всех систем репликации ДНК необходим «стартер» – часть ДНК, который какое-то время сохраняется, а потом удаляется при помощи РНКазы Н.)

Я прилетела в Лондон, мы написали статью и представили в журнал для публикации. Ее не приняли, мы попытались еще раз, и ее опять вернули. Статью неоднократно отвергали, поскольку все научные журналы были твердо уверены – и я поначалу тоже, – что «ножницы» РНКазы Н играли важную роль, поэтому никто не считал нужным искать дополнительные доказательства. Это принималось как факт! И наконец нашу статью опубликовали в Journal of General Virology, который в те годы был не самым престижным журналом. Сейчас, когда эта статья считается важной и относится к наиболее часто цитируемым моим работам, хотя опубликована и не в самом известном журнале, есть о чем задуматься!

РНКаза Н очень распространена, что и объясняет отсутствие ее ингибиторов: они могли бы повлиять на слишком большое количество ферментов и обусловить развитие побочных действий. К этому семейству принадлежат даже интегразы. Они не только оказывают расщепляющее действие, как ножницы, но и заживляют разрезы. «Ножницы» действительно «разрезают» молекулярные связи. Все они содержат три консервативные неперекрывающиеся аминокислоты DDE, удерживающие магний, из 100 аминокислот, которые не консервативны, то есть возможна замена некоторых из них. Однажды я пробовала найти родственные белки, сравнивая последовательности, но не учла DDE и потерпела неудачу, и только кристаллическая структура подтвердила родство. Таким образом, можно сделать очень обобщенное заключение: последовательность генов не имеет значения, а фолдинг («сворачивание» белка) и структура – имеют, так же как в дизайне и изобразительном искусстве «функция определяет форму».

В Японии, перед тем как я была вынуждена уйти из Цюрихского университета, мне сделали прощальный подарок – залитую эпоксидной смолой модель кристаллической структуры РНКазы Н, основанной на последовательности, опубликованной в Nature. Эту модель сделал для меня Роберт Краух из Национального института здравоохранения (Бетесда, США), и красота подарка тронула меня. Сегодня такие изделия в виде двух соединенных сердец можно купить на рынке для близкого друга – и на таких сувенирах даже нет координат, опубликованных в Nature.

РНКаза Н и эмбрионы.

Недавно в организме человека были обнаружены РНКазы Н, не связанные с ретровирусами. Эндрю Джексон и его коллега из Эдинбурга (Шотландия) проанализировали генетические заболевания у человека, в частности синдром Айкарди–Гутьереса (AGS), связанный с умственной отсталостью. К их немалому удивлению, виновником этого заболевания оказалась РНКаза Н. Ранее этот фермент не обнаруживали в организме человека. Белок состоит из трех субъединиц – РНКазы Н2А, В и С, и лишь одна из них активна. Кроме того, в митохондриях находится РНКаза Н1. Возникло подозрение, что она имеет бактериальное происхождение, поскольку бактерии являются предшественниками наших митохондрий. Клеточная РНКаза Н удаляет отдельные нуклеотиды РНК в наших ДНК-геномах, если некоторые из них случайно туда включаются. Наш геном содержит сотни таких ошибок включения, что, похоже, случается достаточно часто. «Ножницы» РНКазы Н очищают наш геном от этих неподходящих нуклеотидов, предотвращая генетическую нестабильность. Неудачные попытки такого очищения приводят к развитию заболеваний, в частности AGS. В настоящее время специалисты по генетической нестабильности вносят некоторую новизну в несколько старомодные встречи ученых по проблемам РНКазы, которые проводятся раз в два года.

Почему же одного типа РНКазы Н достаточно для ВИЧ, когда организму человека необходимо три? Существует следующий принцип: чем более высокоорганизован организм, тем он сложнее. Клеточной РНКазе Н в организме млекопитающих приходится выполнять дополнительные функции, которые распределяются на несколько белков. И невыполнение одной функции имеет фатальный исход, «эмбриональную смерть».

Часто приходится наблюдать, что мультибелковые комплексы у млекопитающих играют определенную роль в эмбриогенезе. У ВИЧ нет эмбрионов, и поэтому достаточно простой РНКазы Н. Однако РНКаза Н, называемая PIWI, играет чрезвычайно важную роль в сайленсинге (особенно в стволовых клетках), направленном на предотвращение «перепрыгивания» генов (так называемые двигающиеся ретротранспозоны). Таким образом, PIWI (вместе с некоторыми РНК) защищают наш геном и необходимы для обеспечения фертильности семенной жидкости.

РНКаза Н диверсифицирует свои функции путем комбинирования различных строительных блоков в модулирующем режиме. Слияние РНКазы с большим количеством различных доменов обусловливает появление новых функций. Все ферменты сами по себе обладают способностью к расщеплению, но где, когда и как эта способность проявляется, зависит от партнера по слиянию. Известно примерно 10 таких партнеров. И обратная транскриптаза – лишь один из них. Она тянет за собой РНКазу Н (которая выполняет функцию нуклеазы, расщепляющего фермента) вдоль РНК, и, когда обратная транскриптаза останавливается или «спотыкается», РНКаза, используя возникшую паузу, делает разрез (ее каталитическая активность медленнее, чем у обратной транскриптазы). Вызывает удивление существование большого количества РНКаз Н, выполняющих неожиданные функции. Я изучала вирусную РНКазу Н несколько десятилетий и, возможно, отношусь к этому вопросу очень предвзято. Многие другие функции были выявлены позднее благодаря новым технологиям секвенирования. Меня весьма удивило, что РНКаза встречается чаще всего и является самой древней структурой в мире белков, а по распространенности превосходит даже ОТ. Об этом свидетельствуют результаты недавно проведенного филогенетического анализа, основанного на последовательностях генов, определенных Густаво Каэтано-Аноллесом из Иллинойского университета (Урбана). Везде, где есть нуклеиновые кислоты, нужны и «ножницы», чтобы вырезать или «выключить» нуклеиновые кислоты. РНКазы имеют целый ряд обозначений, в частности Drosha, Argonaut, Cas9 и PIWI. РНКаза Н и обратная транскриптаза – одни из наиболее важных компонентов для развития и формирования целостности геномов – это относится и к нашему геному, и к геномам других видов. Я говорю это не только потому, что РНКаза Н и обратная транскриптаза – основная тема моих исследований. Это действительно правда!

Теломераза и вечная жизнь.

Можно ли жить вечно? Древнейшая мечта человечества – жить вечно. Возможно ли это? Да, возможно. Существуют клетки, способные жить вечно, этот факт меня очень удивил. К сожалению, это опухолевые клетки. Все клетки нашего организма живут недолго и даже меньше, чем организм в целом. В течение жизни все клетки постоянно восполняются стволовыми клетками. Но это не касается раковых клеток. Практически во всех лабораториях есть клеточная линия HeLa, которой уже более 60 лет. Клетки HeLa – рабочие лошадки для многих исследователей. Источник их происхождения – карцинома шейки матки женщины, которую мы обычно называем Хелен Ланге, хотя на самом деле ее звали Генриетта Лакс: афроамериканка, мать пятерых детей, умершая в возрасте 31 года от карциномы шейки матки. В 1951 г. эти клетки поместили в культуру и вырастили – до этого процедура не удавалась. Вероятно, эта опухоль была агрессивно растущей. В настоящее время наследники Генриетты предъявляют претензии и заявляют, что ничего не знали о ее клетках. Этой теме посвящаются телепередачи, а в 2010 г. появилась новая книга – «Бессмертная жизнь Генриетты Лакс»[10]. Геном клеток секвенировали, и родственников Генриетты беспокоит, что может появиться информация о генетических особенностях, может быть, даже дефектах, носителями которых они могут являться. С тех пор результаты, касающиеся данной клеточной линии, сообщаются финансирующим организациям. Однако мне представляется маловероятным, что клетки после примерно 6000 пассажей в нестандартизированных условиях остались прежними. Будет много хромосомных изменений. Мне кажется удивительным, что опухолевые клетки могут жить «вечно». Почему бы им не существовать чуть дольше, чем обычным клеткам пациентов, но почему вечно? (В лабораторных условиях, конечно, но все же!) Как опухолевые клетки могут жить вечно? Можно ли, основываясь на результатах исследования этих клеток, получить представление о долговечности без развития рака? В интервью меня часто спрашивают, какие еще клетки живут вечно. Наши зародышевые клетки переходят из одного поколения в следующее – значит ли это, что они бессмертны? А стволовые клетки – как долго они могут существовать? Им нужна соответствующая ниша, поэтому возраст и возможности долгожительства зависят еще и от внешних условий. Мелкие животные типа жуков жили «тихонечко» долго и сохраняли жизнеспособность в течение 40 лет в условиях глубокой заморозки при –20 °С.

Одним из отличительных свойств опухолевых клеток является наличие теломеразы, специализированной формы обратной транскриптазы. Она называется теломеразной обратной транскриптазой (TERT), локализуется на концах всех хромосом и проявляет активность в период эмбрионального развития, когда происходит элонгация концов хромосом, в результате чего образуется буферная зона. Элонгация представляет собой монотонный многократный повтор участков, состоящих из семи нуклеотидов. После рождения эти концы становятся короче с каждым делением клетки, так как для функционирования механизма репликации ДНК необходимо некоторое пространство, что-то вроде места для разворота. После этого участок потерян, то есть идет работа молекулярных часов, и при каждом раунде клеточного деления концы хромосом становятся все короче и короче, пока процесс не доходит до области с важной генетической информацией, и тогда это становится опасным! В этот момент концы смыкаются и как бы «склеиваются», после чего клетка погибает. Это явление было открыто Барбарой Макклинток, которую я еще раз упомяну ниже. Можно ли, основываясь на длине теломер, предсказать продолжительность жизни? Нет, это невозможно, поскольку у разных клеток разные молекулярные часы, которые идут с разной скоростью, таким образом у теломер длина разная. Тогда возможно ли хотя бы восстановить удаленные концы, чтобы предотвратить гибель клетки и, следовательно, продлить ее жизнь? Это может стать целью исследований, однако долгоживущие клетки могут оказаться опухолевыми. К таким клеткам относятся клетки HeLa. Одно из общих свойств опухолевых клеток – способность бесконечно делиться. В опухолевых клетках теломераза способна вновь активироваться, что вызывает элонгацию концов, как в эмбрионе. Архимед говорил о точке опоры, находящейся вне Земли. В нашем случае «точка опоры» находится не вне хромосомы, а на ее удлиняемых концах.

Можно ли утверждать обратное и задать следующий вопрос: «Существует ли определенный ингибитор, способный остановить рост опухолевых клеток путем инактивирования теломеразы, то есть действуя как противораковый препарат?» Да, есть: в 90% всех опухолей теломераза активна и является потенциальной мишенью терапии. Этот подход разрабатывается рядом институтов и компаний, в частности Институтом Пастера в Париже и компанией Geron Corporation в США.

Можно активировать теломеразу, чтобы продлить жизнь определенных клеток. Это и есть антивозрастная терапия, направленная на достижение вечной молодости, – может быть, даже удалось бы предотвратить появление морщин! Биотехнологические компании заинтересованы в разработке кремов, которые, если верить рекламе по телевидению, «активируют теломеразы». Много ли людей понимают, что это значит? Такие заявления звучат очень научно, особенно когда в рекламном ролике снимаются люди в белых халатах, что делается намеренно, чтобы мотивировать людей приобретать продукт как препарат, – но это обещание не имеет ничего общего с действительностью.

На протяжении многих лет у исследователей рака было некорректное представление о теломеразах, поскольку большинство исследований рака человека проводится на мышиных моделях, хотя у мышей рак развивается без участия теломераз. В связи с этим возникает вопрос, подходят ли мышиные модели для вышеуказанных исследований. Но их трудно заменить другими моделями.

Элизабет Блэкберн из Сан-Франциско и ее бывшая студентка Кэрол Грейдер совместно с Джеком Шостаком получили Нобелевскую премию за открытие теломеразы. В одном эксперименте Шостак показал, что защищенные концы теломераз – обычное явление (он показал это на примере одноклеточного организма тетрахимены, а позже на дрожжах, у мышей и лягушек). Недавно он разработал «интеллектуальную электростанцию» для исследователей, использующих эволюционные подходы и эволюционные технологии, «чтобы обогнать естественную эволюцию природы». Манфред Эйген первым разработал эволюционные биотехнологии для усовершенствования состава химических соединений. Шостак тоже пытается исследовать липидные капли, стремясь понять, что заставляет капли делиться, – речь идет о модели с применением волны колебания для деления клеток.

Нечасто Нобелевскую премию присуждают «дважды», за открытие двух столь родственных молекул, как ОТ и TERT. Возможно, сходство между ними заметили не сразу. В последнее время появляется все больше свидетельств, что теломеразы способны транскрибировать РНК в РНК и восстанавливать поврежденную ДНК – это совсем неочевидные функции для теломеразы.

В качестве противораковой терапии мы использовали теломерические структуры, так называемые псевдоузлы, чтобы получить более плотные «узлы» и блокировать активность теломеразы. При проведении исследования на мышиной модели мы с помощью Элизабет Блэкберн остановили рост опухоли (злокачественной меланомы). Том Чех тоже занимается изучением теломеразы. Однажды я задала ему довольно глупый вопрос: имеет ли теломераза РНКазу Н? Мне до сих пор неловко за свой вопрос, поскольку следовало бы знать, что ответ: нет, нет праймера РНК, который удаляется с использованием РНКазы Н. ДНК элонгируется, а РНК остается в зафиксированном состоянии и копируется дальше с целью наращивания цепочки ДНК. Семь нуклеотидов РНК (TTAAGGG) копируются несколько тысяч раз, и в результате происходит элонгирование теломеры. Кроме того, Том Чех сказал, что, по его мнению, ОТ древнее теломеразы, так как ОТ наблюдается повсеместно, тогда как теломеразы имеют более специализированные функции и в процессе эволюции появились позднее. А может быть, наоборот?

Интересно отметить, что у насекомых выработался другой механизм защиты концов хромосом – в качестве коротких мобильных фрагментов ДНК они используют транспозоны, которые мигрируют и связываются с концами хромосом. Это напоминает наращивание волос парикмахером и не предусматривает собственно роста волос. Однако даже транспозоны являются носителями фермента транспозазы, которая родственна теломеразе и обратна транскриптазе, первая фиксируется на теломере, а вторая подвижна. Являются ли теломеразы вырождающимися транспозонами? Для защиты концов хромосом выработались разные механизмы, и все они имеют отношение к ретровирусам и обратной транскриптазе.

Вирусы как клеточные ядра?

Эукариоты содержат ядра, от которых и получили такое название. По аналогии бактерии, не имеющие ядра, называются прокариотами.

Бактерии и клетки могут существовать в симбиозе. Наиболее показательны в этом смысле митохондрии, которые представляют собой бактерии, подвергшиеся эндогенизации и дегенерации, и не могут покинуть клетку. Они отдали 90% своих генов ядру клетки-хозяина. Некоторые гены также утеряны. У митохондрий из существовавших когда-то 3000 генов осталось всего 300. Они приобрели очень выраженную специализацию, превратились в клеточные электростанции и обеспечивают клетки энергией. А все остальное необходимое им предоставляет клетка.

Мы отметили общий принцип: ради преимуществ специализации при симбиозе утрачиваются гены. Нечто подобное происходило с цианобактериями, которые взяли на вооружение растения, а в настоящее время в виде хлоропластов специализируются на фотосинтезе. Такое на нашей планете наблюдалось лишь дважды – на удивление редко, особенно если учесть, насколько серьезные преимущества в этом случае получает клетка.

Возможно, это все-таки произошло и в третий раз. Кто же стал поставщиком ядер для эукариотов? Известны вирусы-кандидаты, в частности поксвирусы. Даже в настоящее время ретровирус может встраиваться в качестве ДНК-провируса в ДНК поксвирусов. Интеграция происходит в ядре при каждом инфицировании ретровирусом. В ряде случаев в качестве возможных кандидатов источника ядер рассматриваются вирусы герпеса. Еще одним кандидатом мог бы стать псевдовирус, в частности вирус гепатита В. Его ДНК обычно не интегрируется в ДНК клетки-хозяина, но это могло бы способствовать интеграции ДНК ретровируса или иной ДНК. Произошедшая в прошлом интеграция ДНК-провирусов из ретровирусов в наш геном может быть обнаружена и сегодня. До 50% нашего генома связно с интегрированными ретровирусами. Сформировали ли они наш геном, а еще и ядро?

Мы до сих пор не обсудили вопрос, откуда появились первые клетки. Первичные клетки относят к древнейшим универсальным общим (или клеточным) предкам (LUCA[11]). Был ли вирус предшественником LUCA? В чем заключается роль вирусов? Только ли в поставке ядер или, возможно, в формировании клетки в целом?

Гигантские вирусы, на которых мы подробно остановимся далее, укрепляют подозрение, что вирусы могли быть предшественниками клеток. Если LUCA представлял собой вирус, его нужно было бы назвать LUCAV, где V обозначает вирус, как предложил Евгений Кунин из Национального института здравоохранения (Бетесда, США). Он имеет в виду не превирус, не отдельно взятую последовательность генов вируса, а смесь большого количества различных последовательностей генов вируса, напоминающую квазивиды Манфреда Эйгена. И все же Эйген не считает, что сначала появились вирусы, что они сыграли важную роль на начальном этапе эволюции. Были ли бактерии «раздувшимися» вирусами? Данные проведенных недавно анализов подтверждают такую точку зрения, поскольку имеется широкий спектр вирусов – от мелких до гигантских, и последние оказываются даже крупнее некоторых бактериальных клеток. Луис Вильярреаль (Калифорния), так же как Евгений Кунин из Бетесды, долгое время является противником концепции первичности вирусов – точки зрения, согласно которой эволюция шла от вирусов к клеткам. Самые первые клетки и вирусы были похожи. Они представляли собой маленькие мешочки, состоявшие из липидных мембран и заполненные все более увеличивающимся количеством биомолекул, первых молекул, на основе которых возникла жизнь на Земле. Этот переход от вирусов к клеткам был не резким, а развивался постепенно, поэтому не обязательно придерживаться догматичной позиции в вопросе о том, что было первой простой структурой: вирус или клетка.

Вирусы для выявления вирусов – ПЦР.

Обратная транскриптаза имеет большое значение не только для репликации ретровирусов и функционирования механизма «копировать и вставить», который действует в наших ДНК-геномах, но еще и в повседневной работе исследовательских лабораторий. Обратная транскриптаза играет важную роль в осуществлении полимеразной цепной реакции, системы амплификации. Эта система напоминает упрощенную репликацию вируса в пробирке, где происходит экспоненциальная амплификация генов. Эта технология стала революционным событием в области диагностики, поскольку до сих пор остается наиболее чувствительным методом выявления нуклеиновых кислот в микроорганизмах, вирусах, бактериях, опухолевых клетках, образцах любых тканей, ископаемых останках, мумиях, шерсти вымерших бизонов и т.д. Можно выявить даже мутации – единичные генетические изменения. Часто во время обычных посещений врача ПЦР проводится в целях диагностики либо мониторинга статуса заболевания или же реакции организма на терапию, поскольку эта реакция чрезвычайно быстро дает результаты. Получить несколько миллиграммов образца вполне возможно, и этого объема достаточно для проведения окрашивания – метод, который позволяет «увидеть» амплифицированную ДНК. Затем амплифицированная ДНК подвергается дополнительному анализу (секвенирование). Возможны варианты: если исходный материал представляет собой РНК, тогда применяется обратная транскриптаза для получения ДНК – так же, как для репликации ретровируса. Количество РНК отражает активность гена, что является информативным показателем, используемым в исследовательских и медицинских целях. Не соответствующая норме экспрессия может служить признаком заболевания. Поэтому важно провести количественную ПЦР с детекцией в реальном времени, и этот аналитический метод используется очень часто. Такой анализ называется «профилирование экспрессии» и проводится для определения активности всех генов клетки. Он характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью: например, в контексте ВИЧ вирусная нагрузка может определяться на очень низком уровне – 20 вирусных копий на 1 мл. Именно это в газетах называется «излечение», однако на самом деле речь идет не о реальном излечении, а о снижении количества вирусов до неопределяемого уровня. За счет использования технологических приемов удается ускорить реакцию и сделать ее более специфической, а термостабильные ферменты, предназначенные для реакции копирования, позволяют осуществлять полностью автоматическую амплификацию. В Йеллоустонском национальном парке такие ферменты обнаружили в гейзере с температурой воды 60 °С, но потом их стали находить во многих других термальных источниках. Говорят, что один ученый, желая получить термостойкие бактерии из такого термального источника для выделения термостабильной ОТ, поскользнулся на краю кратера и в результате потерял ногу. Если это правда, это очень печально. Этот фермент называется Taq-полимеразой, где Taq означает термостойкую бактерию Thermus aquaticus (это не архея).

Этот метод настолько чувствительный, что позволяет амплифицировать нуклеиновые кислоты из столь малого количества, что они могут оказаться «ни при чем» или не связаны с заболеванием – тем не менее! Поэтому сверхчувствительность метода может быть контрпродуктивна, а слепая вера в него – неправомерна и даже опасна. На самом деле мы не знаем, может ли наша иммунная система удалить незначительное число патогенов или даже раковых клеток, чтобы мы никогда не заболели, но это можно выяснить с помощью ПЦР, и это нас беспокоит.

Однако этот метод действительно помог нам найти утечку опасных фрагментов ДНК ВИЧ в одном из ламинарных боксов, которые попали туда из пробирок. А поскольку мы разрабатывали вакцину от ВИЧ на основе ДНК, то оказались вакцинированными ДНК, находившимися в лабораторном воздухе. При помощи ПЦР удалось найти утечку. Есть еще один недавний, более известный пример: с помощью ПЦР удалось идентифицировать английского короля Ричарда III по останкам из могилы, находящейся под парковкой в Лестере, сравнив ДНК этих останков с ДНК ныне здравствующих членов королевской семьи. Для восстановления филогенетических деревьев мамонтов достаточно шерсти, а для реконструкции миграционных путей первых ископаемых гоминидов вполне достаточно небольших костных образцов. Можно даже реконструировать пищу через несколько тысяч лет. Так же как можно обнаружить микроорганизмы в смоге Нью-Дели или Пекина. ПЦР радикально изменила процесс поиска преступников и убийц, и в настоящее время для определения личности достаточно буквально капли биологической жидкости или волоса. Все это стало возможно благодаря ПЦР.

Этот метод вызвал споры, поскольку несколько ученых претендовали на его открытие. Потом о нем забыли, а позднее открыли снова и усовершенствовали. Это был последний прорыв. Патентообладателем на данный метод является компания Hoffman La Roche, которая и получает роялти, но в научных целях этим методом можно пользоваться бесплатно. Изобретатель этого метода – человек необычный. После того как он несколько лет разрабатывал данную технологию в Cetus Co., его уволили из компании. Как мне рассказывали, ему заплатили $10 000, а продали эту технологию Hoffman La Roche за $300 млн. И все же справедливость наконец восторжествовала и эксцентричный изобретатель Кэри Муллис в 1993 г. получил Нобелевскую премию за открытие в области химии. Выступая с речью на церемонии вручения премии, он с сожалением сказал, что Нобелевская премия разрушила его отношения с девушкой! The New York Times писала, что его метод разделил биологию и медицину на две эпохи – до и после изобретения ПЦР.