Сбор биологического материала (мокроты) для микробиологической диагностики.

Основные принципы правильного сбора биологического материала (мокроты) для микробиологической диагностики туберкулеза.

Важную роль в микробиологической диагностике туберкулеза играет правильный сбор биологического материала, чаще всего мокроты. Все требования, предъявляемые к сбору патологического материала (мокроты), направлены на выполнение двух основных задач:

1. получить наиболее достоверную информацию о наличии у пациента туберкулеза, для чего необходимо обеспечить правильный сбор, хранение и своевременную доставку материала в лабораторию;

2. защитить персонал от возможного заражения, так как процедура сбора мокроты характеризуется высоким риском инфицирования.

Важным требованием и обязательным условием сбора мокроты является непосредственный – контроль медицинским работником всей процедуры сбора. Образцы мокроты, взятые под контролем медицинского работника, более достоверны и ценны, чем взятые пациентом самостоятельно.

Как правило, в каждой организации или отделении необходимо выделить медицинского работника, в функциональные обязанности которого входит контроль правильности и качества сбора мокроты. Это позволяет обеспечить высокую эффективность микробиологического исследования на туберкулез и надежную защиту от заражения.

Место для сбора мокроты.

В целях обеспечения мер безопасности при сборе мокроты и предупреждения инфицирования потенциально заразными аэрозолями медицинского персонала сбор мокроты должен осуществляться в специально оборудованном помещении (комнате или кабине для сбора мокроты), которое используется только для этих целей.

Данное помещение должно быть оснащено бактерицидными лампами, локальной вытяжной или приточно-вытяжной вентиляцией. При отсутствии вентиляционного оборудования в помещении необходимо иметь окно для проветривания.

Кабина должна иметь прозрачную стенку или окно из прозрачного стекла или пластика для контроля медперсонала за пациентом.

На дверях комнаты для сбора мокроты должен висеть знак, запрещающий входить в комнату другим пациентам или родственникам и напоминающий медработникам о том, что, входя в комнату, они должны надевать для защиты органов дыхания респиратор.

При невозможности оборудовать помещение для сбора мокроты данная процедура может осуществляться на улице, вдали от посторонних.

Требования к емкости для сбора мокроты.

Материал для исследования на микобактерии туберкулеза собирают в чистые флаконы с плотно завинчивающимися крышками, чтобы предотвратить заражение окружающей среды и предохранить собранный материал от загрязнения.

Флаконы для сбора диагностического материала должны отвечать следующим требованиям:

1. иметь диаметр не менее 30 мм;

2. иметь достаточный объем (40–50 мл);

3. должны быть изготовлены из ударостойкого материала;

4. должны быть удобными в обращении, прозрачными или полупрозрачными, чтобы можно было оценить количество и качество собранной пробы, не открывая крышку;

5. должны легко расплавляться при автоклавировании.

Если используют контейнеры многоразового использования, то они должны быть изготовлены из толстого стекла и иметь завинчивающуюся крышку.

Для очистки и стерилизации контейнеры многоразового использования необходимо прокипятить в воде с мылом, другим чистящим средством или дезинфицирующим веществом в течение, по крайней мере, 30 минут. Затем тщательно промыть контейнеры в чистой воде и простерилизовать в сухожаровом шкафу.

Обучение пациента правилам сбора мокроты.

При назначении микробиологического исследования мокроты с целью выявления микобактерии туберкулеза врач или медсестра должны у объяснить пациенту сущность и значение данной диагностической процедуры, а также кратность и методику проведения. Очень важно объяснить различие между получением мокроты и слюны или носоглоточной слизи и подчеркнуть недопустимость использования слюны в качестве объекта исследования. Этого можно добиться в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких (2–3) глубоких вдохов. Нужно также предупредить пациента, что он должен предварительно прополоскать рот кипяченой водой и/или почистить зубы для удаления основной части вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатков пищи, затрудняющих исследование мокроты.

Образцы инструкции и памятки для пациента по сбору мокроты представлены в Приложении 1.

В отношении образца мокроты, которую пациент должен собирать самостоятельно, необходимо объяснить, что лучше эту процедуру проводить вне дома на открытом воздухе, а если это невозможно, то ему необходимо откашливать мокроту в отсутствие других людей и перед открытым окном/форточкой. Кроме того, необходимо объяснить пациенту, что он должен как можно быстрее принести собранный образец в медицинскую организацию.

Процедура сбора мокроты.

В таблице 2.1 поэтапно описана процедура сбора мокроты:

Таблица 2.1 Основные этапы сбора мокроты.

Этапы сбора мокроты	Краткое описание
Подготовка к сбору мокроты	Медицинский работник повторно объясняет пациенту методику, важность данной процедуры для установления правильного диагноза. Пациент должен тщательно прополоскать рот и горло водой или содовым раствором.
Процедура сбора мокроты	Медицинский работник должен находиться позади пациента или возле окна снаружи отгороженной стеклом или пластиком кабины для сбора мокроты. Прекратить сбор мокроты можно при достижении 3-S мл объема.
После 1 осуществления сбора 1 мокроты	Медицинский работник должен попросить пациента закрыть контейнер с мокротой и передать ему. Проконтролировать герметичность закрывания контейнера. Промаркировать образец (этикетка с фамилией, датой и номером порции приклеивается на боковую стенку контейнера, но не на крышку). Поместить контейнер с мокротой в контейнер для транспортировки биологического материала для доставки в лабораторию. Заполнить верхнюю часть направления на проведение микроскопии мокроты (см. Приложение 2). Если сбор мокроты проходил в комнате для сбора мокроты (не на улице) – тщательно проветрить помещение и течение не менее 15 минут. открыв окно.

Образцы с мокротой отсылают в лабораторию в день сбора. Цели это невозможно, то до поступления в лабораторию образцы мокроты хранят в отдельном холодильнике при t + 4–8°С не более 48–72 часов.

Кратность сбора образцов мокроты.

У каждого пациента с подозрением на ТБ следует собрать 3 образца мокроты (даже если рентгенограмма грудной клетки этого пациента без патологии).

Для сокращения числа визитов в медицинскую организацию образцы мокроты у каждого пациента с подозрением на ТБ следует собрать в течение 2 дней клинического обследования, следуя методике, описанных в таблице 2.2.

В число образцов мокроты для первичного исследования входят: два образца мокроты, которые собирают под непосредственным наблюдением медработника «на месте», во время посещения пациентом медицинской организации;

Еще один образец, который пациент собирает у себя дома, рано утром натощак (после того, как он почистит зубы, чтобы в мокроту не попали частицы пищи).

Таблица 2.2. Кратность сбора образцов мокроты: порядок действия медицинского работника и пациента.

Сбор первого образца мокроты (1-й день)	Работник ПМП должен: при первом обращении в медорганизацию пациента с подозрительными на ТБ симптомами он собирает под непосредственным наблюдением первый образец мокроты; – объяснить пациенту необходимость трехкратного сбора мокроты и правила ее сбора в домашних условиях; – выдать пациенту контейнер для сбора мокроты и объяснить, что мокроту нужно собрать в этот контейнер утром следующего дня и доставить образец в медорганизацию; – написать идентификационный номер образца на внешней стороне контейнера (но не на крышке).
Сбор второго образца мокроты (2-й день)	Пациент должен: самостоятельно откашлять второй образец мокроты в выданный контейнер сразу после пробуждения (утром, натощак, но посте чистки зубов); как можно скорее доставить собранный образец в медицинскую организацию.
Сбор третьего образца мокроты (2-й день)	Работник ПМП должен: под непосредственным наблюдением собрать третий образец мокроты пациента, после того как тот придет в медорганизацию и принесет второй образец мокроты, собранный им утром в домашних условиях.

Получение индуцированной мокроты.

Индуцированная мокрота (ИМ) – это секрет слизистой трахеи и бронхов, полученный после проведения раздражающих ингаляций. Как правило, сбор ИМ производится у пациентов в условиях стационара:

1. с симптомами заболевания легких и бронхов при отсутствии, мокроты или выделения;

2. с рентгенологическими изменениями в легких при сухом кашле и скудном выделении мокроты.

Раздражающая ингаляция проводится с помощью ультразвукового или компрессорного небулайзера. В качестве ингалируемой смеси рекомендуется 5–10% раствор поваренной соли.

Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен быть исследован в день сбора. Во избежание «выбраковки» ИМ в лаборатории в направлении следует сделать специальную отметку «индуцированная мокрота».

Исследование полученных образцов мокроты.

Взятие диагностического материала для микробиологической диагностики туберкулеза должны осуществлять все организации ПМП и общелечебной системы здравоохранения.

После сбора мокроты возможно исследование полученных образцов на месте (если на базе данного учреждения функционирует лаборатория I уровня).

В случае отсутствия в организации лаборатории, выполняющей исследования на КУБ, образец мокроты или зафиксированный мазок направляют на исследование в ближайшую лабораторию I уровня.

Направление диагностического материала в лаборатории II или III уровня для проведения бактериологического исследования возможно непосредственно из лечебной организации, где осуществлен забор биологического материала, или из лаборатории I уровня.

Значение и разрешающая способность микроскопии мокроты.

Микроскопическое исследование мокроты у пациентов, обратившихся за врачебной помощью с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления заболевания, так как позволяет быстро выявить возбудителя инфекции и наиболее эпидемически опасных пациентов. Возрастание роли данного метода в выявлении туберкулеза связано также с появлением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным бактериовыделением.

Микроскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным методом выявления пациентов, больных туберкулезом.

Бактериоскопическое исследование обладает высокой специфичностью (89–100%). Около 57%. положительных результатов микроскопии подтверждаются результатами посева. Тем не менее, поскольку в природе существует большое число морфологически сходных с МБТ нетуберкулезных кислотоустойчивых микроорганизмов, микроскопическое исследование позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий (КУБ). При микроскопическом исследовании мазка патологического материала определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых бактерий нельзя.

Разрешающая способность микроскопического исследования по Цилю-Нильсену составляет от 5 до 10 тысяч микобактерий в I мл мокроты.

Методы микроскопии мокроты.

С целью диагностики туберкулеза используют 2 метода микроскопического исследования:

1. метод прямой-микроскопии, когда мазок готовят непосредственно из диагностического материала;

2. метод микроскопии осадка, полученного из обработанного деконтаминантом материала для культурального исследования.

Лучшие результаты микроскопического исследования получают при концентрировании диагностического материала центрифугированием. Такое исследование проводят в лабораториях, осуществляющих бактериологическую диагностику туберкулеза.

Для исследования мазков, окрашенных но Цилю-Нильсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (90- или 100-кратное увеличение) и окуляром с 7- или 10-кратным увеличением. Исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления в мазке единичных микобактерий. В случае, если результат исследования 100 полей зрения отрицательный, рекомендуется просмотреть еще 200 полей зрения.

Результаты микроскопического исследования оценивают количественно (табл. 2.3).

Таблица 2.3. Оценка результатов микроскопического исследования мокроты по Цилю-Нильсену.

Результат исследования	Минимальное число полей зрения, обязательных для просмотра	Форма записи результата	Интерпретация результата исследования
КУБ не обнаружены в 300 полях зрения	300	Отр.	Отрицательный
1–2 КУБ в 300 полях зрения	300	Рекомендовано повторить исследование	Результат не оценивают
1–9 КУБ в 100 полях зрения	100	«_» КУБ в 100 полях зрения (указывается точное число)	Положительный
10–99 КУБ в 100 полях зрения	100	1 +	Положительный
1–10 КУБ в 1 поле зрения	50	2+	Положительный
10 КУБ в 1 поле зрения	20	3+	Положительный

В лабораториях, выполняющих большое количество микроскопических исследований (100 и более ежедневно), может использоваться люминесцентная микроскопия.

Особенности бактериоскопии при внелегочном туберкулезе.

Для бактериоскопической диагностики внелегочного туберкулеза осуществляют прямую микроскопию диагностического материала (плевральной, спино-мозговой жидкости), а также микроскопию мазков, приготовленных после обогащения с последующей окраской по Цилю-Нильсену или люминесцентными красителями. Прямая микроскопия мазков менее эффективна в связи с низкой концентрацией микобактерий в материале, поэтому рациональнее использовать методы обогащения, в частности, центрифугирование. Помимо этого, проводится посев материала для культуралыюго исследования.

Бактериоскопия мочи, менструальной крови не проводится, в связи с крайне низкой результативностью исследований.

Значение культуральных исследований для выявления возбудителя туберкулеза.

Культуральное исследование (посев) диагностического материала на МБТ, благодаря высокой чувствительности (от 20 до 100 жизнеспособных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом, является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Как уже указывалось ранее, культуральное исследование выполняется лабораториями П, III уровня, а также Республиканской референс-лабораторией, являющимися структурными подразделениями государственных организаций здравоохранения, оказывающих медицинскую помощь в стационарных (амбулаторных) условиях.

Культуральное исследование с последующем определением ТЛЧ для положительных образцов проводится для всех пациентов, больных ТБ или с подозрением на ТБ, перед началом лечения противотуберкулезными лекарственными средствами.

По сравнению с микроскопией, культуральное исследование позволяет увеличить число выявленных пациентов, больных туберкулезом, более чем на 15–25%, а также верифицировать туберкулез в более ранних стадиях, когда заболевание еще хорошо поддается лечению. Очень важным преимуществом культурал ь но го исследования является возможность получения культуры возбудителя туберкулеза, которая может быть идентифицирована и изучена в отношении лекарственной чувствительности.

В настоящее время в качестве методов, альтернативных классическому культуральному исследованию, используются i автоматизированные системы для ускоренного выявления микобактерий и определения чувствительности МБТ к противотуберкулезным лекарственным средствам (ВАСТЕС MGIT 960 и др.), которые позволяют проводить детекцию роста микобактерий и определять лекарственную чувствительность МБТ в 2–3 раза быстрее по сравнению с классическими методами (в среднем в течение одного месяца).

В ближайшее время станут доступными для широкого применения методы молекулярно-генетическнх лабораторных исследований, позволяющие провести верификацию микобактерий туберкулеза и определение резистентности к рифампицину и изониазиду в течение 2 суток (HAIN-тест и GenExpert), рекомендованные к применению Всемирной организацией здравоохранения для более эффективной борьбы с МЛУ-ТБ.